DAPI染色原理及DAPI染色步骤

DAPI染色DNA的原理及DAPI使用方法

DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式为C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。

DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处，一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍，常用与荧光显微镜观测，根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。单独DAPI的更大吸收波长为340nm，更大发射波长为488nm；当DAPI与双链DNA结合时，更大吸收波长为364nm，更大发射波长为454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5，其发散光的波长范围约在500nm左右。

DAPI实验的基本原理：

利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的配制及贮存

固体粉末 ：避光，2-8 ℃保存，3年没有问题。
贮存液 ：用无菌水配制成浓度1 mg/ml 的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，可在-20 ℃下长期保存。（DAPI易溶于水，在PBS中溶解度不高）
使用浓度 ：贮存液用1xPBS稀释到终浓度100 ng/ml。
荧光封片液 ：0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5
染色与观察 ：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm。
注意事项 ：DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。

DAPI实验步骤

1)在染色前的细胞密度约是0.8X105/孔（293T细胞/六孔板每孔）。
2)移去完全培养基，用PBS清洗一次。
3)用10％的甲醛溶液或者4%的多聚甲醛PBS在室温固定20分钟。
4）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
5）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15分钟。
6）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
7）在室温用含10%NGS的PBS封闭1小时，或者在4摄氏度封闭过夜。
8）在37摄氏度用特异性一抗孵育半小时，或者在室温下孵育一小时以上或者4摄氏度孵育过夜。
9）用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
10）用铝箔包裹后在37摄氏度用二抗孵育半小时以上，或者在室温下孵育一小时以上。
11）去除二抗，加入DAPI染色液室温作用15分钟以上。
12）用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
13）在荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。

dapi染色观察到蓝色荧光是活细胞还是死细胞？
DAPI染色不能区分活死细胞，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。活细胞死细胞都能够被DAPI染色，所以光看到蓝色荧光，无法区分。
DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。类似于DAPI技术，赫斯特染色是一种既可以用于活细胞也可以用于固定细胞的蓝色荧光染料，并且可以使用与DAPI相同的机器滤镜设置。

dapi染料的激发光波长和发射光波长光谱图：