Northern Blot实验操作步骤

实验原理：
在变性条件下将待检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，使其按照分子量大小分离。按照同Southern Blot相同的原理进行转膜，并使用探针进行杂交检测。相比RT-PCR等技术，Northern blot具有稳定、可靠、假阳性少等优点。

实验目的：
检测样品中某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。比较两个或两个以上的不同样品中某一基因的转录差异

材料与试剂

进口RNAase free 1.5 ml和0.5 ml管子*
进口RNAase free 20 μl、200 μl枪头*
转膜盘子
玻璃棒
玻璃板
胶片
滤纸
洗膜盒
DEPC水*
*注：需经高温高压灭菌处理。

Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (TAKARA, catalog number: D6045)
琼脂糖
NaAc
NaOH (国药试剂)
EDTA (国药试剂)
MOPS (上海生工)
NaH2PO4 (国药试剂)
H3PO4 (85%，国药试剂)
NaCl (国药试剂)
Na3Citrate (柠檬酸三钠，国药试剂)
SDS (国药试剂)
Deionized formamide (上海生工)
37% formaldehyde (甲醛，国产)
Glycerol (国产)
Bromphenol Blue (溴酚蓝，Sigma)
Xylene Cyanol (二甲苯氰，Sigma)
1 M NaAc (pH 7.0) (见溶液配方)
4 N NaOH (见溶液配方)
0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
10x MOPS buffer (见溶液配方)
1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2) (见溶液配方)
20x SSC (见溶液配方)
10% SDS (见溶液配方)
Sample buffer (见溶液配方)
转膜缓冲液 (见溶液配方)
Blue juice (loading buffer) (见溶液配方)
Hibridization buffer (见溶液配方)
洗膜液 (见溶液配方)
4x SSC (见溶液配方)

仪器设备

烧杯
量筒
梳子
烧瓶
灭菌锅
电泳槽
电泳仪
离心机

水浴锅
通风橱
超净工作台
摇床
-20 °C冰箱
紫外交联仪
FLA-5100型荧光/化学发光及同位素影像扫描分析仪

实验步骤

一、转膜前预处理

先用稀释好的0.4 N NaOH将转膜需要用到的器皿浸泡过夜 (盘子、玻璃棒、玻璃板、烧杯、量筒、胶片、跑胶用的梳子、挡板、胶槽和制胶用的烧瓶)，然后用DEPC水清洗2~3遍，晾干待用。

二、跑胶及转膜

先将100 ml 10x MOPS用灭菌的DEPC水稀释至1x MOPS (1 L)，取75 ml 1x MOPS (中号电泳槽半板) 制备1%~1.2%浓度琼脂糖胶。琼脂糖加热融化后，冷却至70 °C加37%甲醛，使终浓度为2% (75 ml中加4.3 ml甲醛)，通风橱中放1 h。剩余的1x MOPS buffer 倒入中号槽，用作电泳缓冲液。
抽提质量完好的样品RNA测好浓度后按以下体系加样：
15 μg RNA+灭菌的DEPC水 10 μl
Sample buffer 8 μl
loading buffer 2 μl
EB (10 mg/ml) 0.03 μl
加样时候，先加好RNA和DEPC水，离心机短暂离心。将Sample buffer、loading buffer和EB 按照比例配成mixture，然后向每个样品中各加10 μl。加好后，离心，65 °C水浴变性10 min，立即放冰上，点样前再用离心机甩一下。

将胶放入加好电泳缓冲液的中号槽中，预电泳5 min。按顺序点样，不要漏出，记好样品顺序。
在中号槽中，用100 V电压电泳1 h，直至最前方的蓝色染料距离点样孔约3.5~4 cm。将电泳好的凝胶在凝胶成像系统中照相，观察RNA质量及凝胶电泳情况，此时应该在成像中看到RNA无降解，并且28S和18S刚好分开。这一步拍摄的图像用于结果分析中对于样品RNA上样量和完整性进行描述。
在500 ml 4x SSC中加27 ml 37%甲醛(终浓度为2%)溶液，混匀用作转膜缓冲液(转膜缓冲液见溶液配方)。转膜具体步骤同Southern (参见“Southern Blot”吴昊等，2018)，不同的是所用的转膜盘子，玻璃板，玻璃棒等都是要用预先DEPC水处理好的。一切操作要在通风橱内进行，以避免甲醛对人体的伤害。

三、杂交 

将凝胶及膜取下，分别在凝胶成像系统中观察凝胶上是否有RNA残留，膜上RNA效果是否完好。(可选内容：用紫外凝胶成像系统将膜中RNA拍摄下来，用作内参对照。也可以在杂交后，将探针洗去，用18S RNA探针再杂交一次，结果作为内参对照)。
将膜放在稀释好的2x SSC中稍漂洗，然后放在干净的滤纸上，在超净工作台上将水分吹干。于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次30 sec，重复一次。在超净工作台上吹5-10分钟。
在杂交管内加入约20~50 ml杂交液(依膜的数量及膜大小而定)，将膜卷起放入，注意有RNA的一面朝内，于64 C杂交炉中预杂交1~4 h，注意杂交管要平衡好。(也可以用杂交袋，加入杂交液后，注意不能有气泡。后面步骤中加完探针后也要消除气泡)。
使用“Random Primer DNA Labeling Kit”进行同位素标记探针。将探针模版(PCR扩增的基因特异片段或基因的酶切片段，经回收)测好浓度后，按以下体系加入：
DNA 3 μl (10 ng~1 μg)
Random primer 2 μl
ddH2O up to 14 μl
dNTP Mixture (不含dCTP ) 2.5 μl
10x Buffer 2.5 μl
Klenow Fragment 1 μl
α-dCTP*(同位素室中加) 5 μl
先加入DNA、random primer和ddH2O，95 °C变性3~5 min，冰上放5 min。短暂离心后，继续加入dNTP和10x Buffer，离心后再加Klenow Fragment酶，加酶时注意低温操作，先加在管壁上。立即到同位素室加入同位素，混匀离心，于37 °C反应30 min。
向探针标记的离心管中加入500 μl杂交液，不盖盖子，放于干浴上，95 °C加热10 min。迅速放于冰中，冷却5 min。取出杂交管，将标记产物加入杂交管，盖紧管盖，于64 °C杂交过夜。
注：所有废物等需按照同位素室的相关规定放入指定容器！

四、洗膜，压片
将杂交管中杂交液倒出，放入指定回收器皿中。取出杂交膜，放入洗膜盒，先用少量洗膜液，冷洗10 min。将膜取出测信号，根据信号大小决定是否热洗。若信号高，换新的洗膜液，放至64 °C摇床上摇(注意转速要调低，盒子要加盖)。中间取出膜检测信号，直到信号值达到适宜为止。当膜上某一区域信号强，而其他区域信号弱代表杂交上了。然后包膜压片，压磷屏，依信号强弱决定时间。也可以压X光片，放于-20 °C 3天左右即可冲洗。

五、结果扫描
在FLA-5100扫描仪中，扫描磷屏。结果扫描完后，将磷屏消磁，杂交膜保存于暗夹中。如果是压X光片，在暗室进行显影和定影。X光片晾干后，用扫描仪将结果保存下来。

六、结果整理
将FLA-5100扫描的结果或X光片扫描结果整理，作成图片，和电泳后的RNA检测结果整合在一起，分析各样品中基因的表达情况。

溶液配方

1 M NaAc (pH 7.0)
82 g NaAc先加一定量灭菌的ddH2O
NaOH调pH值至7.0
灭菌的ddH2O定容至1 L

4 N NaOH
160 g NaOH (国药试剂)
加水至1 L溶解

0.5 M EDTA (pH 8.0)
186.1 g EDTA (国药试剂) 先加一定量灭菌的ddH2O
NaOH调pH值至8.0
灭菌的ddH2O定容至1 L

10x MOPS buffer
MOPS (上海生工) 41.85 g
1 M NaAc (pH 7.0) 50 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml
加一定量未灭菌的DEPC水
4 N NaOH调pH至7.0 (约加7 ml)
未灭菌的DEPC水定容至1 L，灭菌

1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2)
NaH2PO4 (国药试剂) 71 g
H3PO4 (85%) (国药试剂) 4 ml
用灭菌的DEPC水定容至1 L

20x SSC
NaCl (国药试剂) 175.3 g
Na3Citrate (柠檬酸三钠 国药试剂) 88.2 g
用灭菌的ddH2O定容至1 L

10% SDS
SDS (国药试剂) 100.0 g
灭菌的ddH2O定容至1 L (将水加热到68 °C有助于溶解)

Sample buffer
Deionized formamide (上海生工) 1,000 μl
10x MOPS buffer 200 μl
37% formaldehyde(甲醛) (国产) 320 μl

转膜缓冲液
500 ml 4x SSC和27 ml 37%甲醛(终浓度为2%)溶液，混匀

Blue juice (loading buffer)
Glycerol (国产) 70 ml
5x TBE 10 ml
10% SDS 2 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 4 ml
Bromphenol Blue (溴酚蓝，Sigma) 0.5 g
Xylene Cyanol (二甲苯氰，Sigma) 0.5 g
加灭菌的ddH2O定容至100 ml
37 °C摇动混匀过夜

Hibridization buffer
1 M NaH2PO4 buffer 500 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 2 ml
10% SDS 700 ml
BSA 10 g
用灭菌的DEPC水定容至1 L

洗膜液
20x SSC 100 ml
10% SDS 10 ml
用灭菌的DEPC水定容至1 L

4x SSC
20x SSC 200 ml
灭菌的DEPC水定容至1 L

注意事项

Northern blot一个主要的问题是存在RNA酶的污染，所以Northern blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如NaOH浸泡处理、DEPC处理等。
抽提的RNA质量一定要好，这是实验结果好坏的关键，更好浓度比较一致，杂质较少。有条件的话可以先电泳检测。
Norther blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人体都有一定的伤害，要注意保护。
实验所用的标记试剂盒为TAKARA公司的Random Primer Labeling Kit，模板DNA的长度一般不要低于300 bp。