外源蛋白在烟草叶片瞬时表达的实验操作步骤

外源蛋白在烟草叶片瞬时表达   
简要原理：利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作(BiFC)和蛋白的纯化等实验操作。

关键词: 烟草, 外源蛋白, 瞬时表达
 

材料与试剂
1.一次性注射器
2.培养皿
3.本氏烟草 (Nicotiana benthamiana)
4. 农杆菌菌株：EHA105
5.MES
6.MgCl2
7. 乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS) (上海生工，catalog number: A601111)
8. 抗生素 (根据实验需求)
9. LB
10.0.5 M MES (pH 5.6) (见溶液配方)
11. MgCl2溶液 (见溶液配方)
12. 100 mM乙酰丁香酮 (见溶液配方)

仪器设备
1.恒温摇床
2.分光光度计
3.移液枪
4.离心机

实验步骤
1.挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆(菌株：EHA105)于1 ml含有相应抗生素的LB中，28度摇床250 rpm培养24小时。
2.于5 ml含有相应抗生素的LB中，加入100 μl 0.5 M MES，2 μl 100 mM AS，再接种50 μl农杆菌菌液，28度摇床250 rpm培养至OD600=1.0 (大约12-18小时)。
3. 4,000 rpm常温离心10分钟收集菌体，用10 mM MgCl2重悬至OD600=1.0，以每毫升菌液加入2 μl的比例加入100 mM AS，静置3小时以上。
4.取正处于生长旺盛时期(一个月左右，未开花)的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去(见图1)，若注射不顺畅，可用针头在叶片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入。
5.正常条件下放置，24-48小时即可取样。

注意事项
1.有的文献报道烟草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理，个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理，正常条件生长即可，但是用于蛋白互作(BiFC)可能需要特定的条件，可参见BiFC部分 (参见“烟草体系BiFC”，袁猛等，2018)。
2.表达载体的启动子一般是35秒，若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异。
3.一般情况下，转化后24小时即有蛋白表达，而48小时后会渐渐消失。
4.若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因p19超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草，此方法的蛋白表达时间为注射后3-7天，且可以大幅提高表达量，但是只适用于本生烟草 (Nicotiana benthamiana) (Voinnet等, 2003)。
5.如果要抽提并纯化蛋白在未用p19的情况下需5-10 g烟草叶片，加p19的情况下可以减半。

溶液配方
1. 0.5 M MES (pH 5.6)
 MES粉末溶于双蒸水中，利用1 M KOH溶液调pH值至5.6
2.MgCl2溶液
MgCl2粉末溶于双蒸水中
3. 100 mM乙酰丁香酮
 乙酰丁香酮粉末溶于双蒸水中