植物组织培养的设备和操作方法

植物组织培养的设备与使用方法
植物组织培养是在严格的无菌条件下培养植物材料。要达到无菌操作和无菌培养，就需要人为创造无菌的环境，使用无菌的器具，同时还需要人工控制的温度、光照、湿度等培养条件。无菌环境和无菌条件的创造需要一定的设备，实验设备因工作的目的、具体的任务和所具有的条件而异。但大多数采用化学实验室、微生物实验室及医疗上的一些设备、器材和用具。

1. 实验室基本组成
(a)无菌操作室
在植物组织培养中，无菌操作室（clean chamber）是进行植物材料的分离及培养体转移的一个重要场所。由于植物组织培养需长时间的无菌操作，所以无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。微生物的培养生长时间短，而植物组织培养短的一个月，长的达几年。所以，防止细菌和霉菌混入是提高工作效率和影响生产成本的关键。
无菌操作室基本要求是：干净无菌、密闭、光线好。一般安装滑动门，使空气不致流动，以防外界菌及尘埃的侵入；墙壁光滑平整，地面平坦无逢，便于清洁工作；室内安装紫外线灯，以便灭菌，还要有照明装置及灯座，以备临时增加设备之用；室内有超净工作台、便携式激发光源、移动式载物台（医用平板推车）、广口瓶、试管、三角瓶、酒精灯、接种工具、高强度紫外线灯等。面积根据工作性质可大可小，小的无菌操作室一般一间 5~7㎡即可。
接种室内主要安放超净工作台，分单人使用和双人同时连续作业使用两种。超净台中准备接种用的器具，如尖头小镊子、弯头小镊子、接种针、解剖刀、手术剪刀等，以及酒精灯、储存70%酒精浸泡的棉球的广口瓶等。如果进行生长点或幼胚等细小结构的分离与接种，还应当在超净工作台内放置一台小型的双目解剖镜，以便观察、解剖和分离细小的外植体。
小型离心机主要用于分离和收集液体培养中的细胞、单花粉及原生质体等，也可用来筛选处于不同发育阶段的胚状体。无菌室外更好设置预备室作为缓冲间，以防工作人员进出时带进杂菌。控温光照培养箱可以安放在缓冲间内。预备室与无菌室之间更好以玻璃相隔，便于观察和参观。在预备室可放置工作服、鞋、帽等，也需要装自来水和254nm短波紫外线灯。

（b） 化学实验室
组织培养中植物材料是生长在人工配制的培养基上，这就需要在化学实验室预先配制好培养基。化学实验室一般由以下几个部分组成：
（1）洗涤室
主要用于培养容器、玻璃器皿、用具和培养材料的清洗。新购进的玻璃器皿一般先用1%盐酸除去可溶性无机物，再用中性洗涤剂；使用中的玻璃器皿可用洗涤剂清洗，自来水冲洗；对较难洗涤的器皿，如吸管等应用洗液进行洗涤。洗涤室需备有工作台面、上水管和下水管、水池、落水架、电源、干燥箱等。
（2）药品室
用于存放无机盐、维生素、氨基酸、糖类、琼脂、生长调节物质等各种化学药品。要求室内干燥、通风、避免光照。室内设有药品柜、冰箱等设备。各类化学试剂按要求分类存放，需要低温保存的药剂应置于冰箱保存。有毒药品应按规定存放和管理。
（3）称量室
根据需要，配备各类天平。要求干燥、密闭、无直射光照。一般配备 1/100 普通天平和 1/10000 的电子天平，可能的话加配 1/1000 和1/100000 的天平，形成系列。除电源外，应设有防震固定的台座。
（4）培养基配置室
用于配制、分装培养基以及培养基的暂时存放。室内应配有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管、移液器等器具；有平面实验台以及安放药品和器皿的各类药品柜、器械柜、物品存放架；有水浴锅、电饭锅、微波炉、过滤装置、酸度计、分注器以及贮藏母液的冰箱等。
（5）灭菌室
用于器皿、器械、封口材料和培养基的消毒灭菌。要求墙壁耐湿、耐高温。室内需要备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤装置、煤气灶和电炉等。玻璃器皿和小用具的消毒常采用干热灭菌法，150℃约保持 1-3h。培养基、蒸馏水及一些用具，采用 120℃高压蒸汽灭菌法。在没有条件的地方，可将上述工作合并在一个房间内完成，但设备的安装与排列要合理，房间要宽敞、 明亮、通风。
（c）培养室（culture room）是将接种到试管等的培养材料进行培养生长的场所。需配有固定式培养架、旋转式培养架、转床和摇床、控温控光设备，以满足植物器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原生质体的固体和液体培养的需要。
进行固体培养和试管苗大量繁殖时，培养材料通常摆在培养架上，制作培养架应考虑使用方便、节能、充分利用空间以及安全可靠。培养架材料为金属、铝合金或木制品。隔板可用玻璃板、木板、纤维板、金属板等，更好使用玻璃板或铁丝网，既透光，上层培养物又不受热。为使用方便，通常设计为 5-7 层，更低一层离地面高约 50cm，以上每层间隔 30cm 左右，培养架高约1.7-2.3m。一般在每层上方装置日光灯以供补充光照，培养架长度通常根据日光灯的长度设计。宽度可根据工作情况而定，一般装 2 支日光灯，宽40-50cm。更好使用专门为组织培养设计的节能冷光源，其光谱与日光相近且省电。每日照明时间根据培养物的特性不同而有所区别，一般为 10-16h，更好用自动计时器控制光照时间。
培养室要保持一定的温度条件，大多数情况保持在 20-27℃，要求室内温度均匀一致。室内湿度也要求恒定。为防止培养基的干燥和菌类污染，相对湿度为70%-80%为好。温湿度的保持可用空调机或湿机通过继电器、石英定时开关钟、控温仪等来控制。大多数恒温培养，应根据要求预先调节好。温动变动太大，易使培养材料遭受菌类污染。
培养室应保持整洁。有条件的可装置细菌过滤装置。如需进行液体培养，还应根据培养的种类放置摇床、转床等各种培养装置。转床上的培养瓶不停的转动，瓶内培养物交替地处于液相和气相，保证了良好的通气条件，有利于培养物的生长。有的实验要求暗培养，因此应有暗培养的设备，如柜子或无光培养箱。此外，为避免虫类侵染，培养室应杜绝栽培植物。培养室附近也应尽量避免放置盆花等植物。

(d)细胞学观察室
用于观察、记录培养材料的生长情况及结果。室内要有固定的水磨石或瓷砖台板，以放置显微镜、解剖镜、倒置显微镜及照相设备等仪器。
(e)驯化移栽室
用于试管苗的移栽。通常在温室或塑料大棚内进行。室内备有弥雾装置、遮荫网、移植床等设施；钵、盆、移植盘等移植容器；草炭、蛭石、沙子等移植基质。试管苗移植一般要求温室温度在 15℃-35℃，相对湿度70%以上。

2.超净工作台使用
无菌操作应在超净工作台中进行。超净工作台内在都装有一个小电动机，它带动风扇鼓动空气先穿过一个粗过滤器，把大的尘埃滤掉，再穿过一个过滤器，把大于0.3µm的颗粒滤掉，然后这种不带真菌和细菌的超净气流吹过台面上的整个工作区域。由过滤器吹出来的空气的速度大约是（27±3）m/min，所有的污染物都会被这种超净气流吹跑。只要超净工作台不停的运转，在台面上即可保持一个完全无菌的环境，而且这种气流不会吹灭在台面上使用的酒精灯。为了延长过滤器的使用寿命，超净工作台不要安放在尘埃多的地方，需定期检查超净工作台台面上的风速是很有必要的。在每次开动超净工作台时，应让气流吹 10min 后再开始操作。在每次操作之前，要把实验材料和需使用的各种器械、药品等先放入台内，不要中途拿进。同时台面上放置的东西也不宜太多， 特别注意不要把物件堆得太高，以免挡住气流。在使用超净工作台时应注意安全，当台面上的酒精灯已经点燃以后，千万不要再喷洒酒精消毒台面，否则很易引起火灾。

3.无菌操作的步骤
1）将植物组织块放入一个广口玻璃瓶中，加入含有几滴活化剂的浓度适当的消毒液，使材料完全浸没在消毒液中，盖上瓶盖，把玻璃瓶置于超净工作台，在消毒期间不时摇动玻璃瓶。
2）消毒结束后，打开瓶盖，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水（经高压灭菌后），再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，如此重复 3-4 次。
3）将材料取出，放在一个已经灭过菌的培养皿中。
4）在对植物材料进行消毒处理的同时，对所要使用的器械进行消毒，先在90%酒精中蘸一下取出，在酒精灯火焰上消毒，然后放在器械架上冷却备用。所有操作器械在每次使用后均需要再用火焰消毒一次。
5）使用消过毒的器械（如解剖刀、解剖针、打孔器、剪刀等）从已经过表面消毒的材料切取适当的外植体。如果需要用解剖镜，应事先用 70%酒精棉擦拭显微镜台表面进行消毒。
6）打开培养容器，将外植体接种到培养基上。如果使用的是玻璃培养容器，把瓶口置酒精灯火焰上烘烤数秒钟，然后迅速用瓶盖或封口膜封严。