质粒载体构建以及需要注意的事项

质粒构建以及需要注意的事项

1。载体构建
载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。 特点：当给质粒插入一段外源DNA片段后，它依然能够进行自我复制。

2。多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包含数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，每个限制性酶切位点通常是的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的酶切位点可有重叠。单一酶切位点就是只有一种特定的酶能够识别并进行酶切的位点，多克隆位点一般是位于质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。

3。质粒构建
（1）质粒构建原理
质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
（2）质粒构建方式
质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。
（3）质粒载体的制备
质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

4。双酶切
将目的基因重组入质粒构建时选择酶切（这里是指双酶切）位点应注意几点：
（1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。
（2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。
（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。
（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。
（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。
（6）两个酶切点更好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
（7）更好使用酶切效率高的酶。
（8）更好使用双酶切有共同buffer的酶。
注：质粒构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。