GFP在生物技术教学实验的应用方案

绿色荧光蛋白之光--生物技术综合大实验课程教学的改革与探索
生物技术(biotechnology)是以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，以基因工程为核心，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。同时，生物技术也是一门综合性和实践性很强的学科。综合大实验是培养学生在掌握一定的基础知识和基本技能的基础上，综合运用各学科的理论知识和实验技能解决实际问题能力的实践过程。西北农林科技大学生命学院生化与分子生物学教研室为本院三年级本科生，在先修生物化学、分子生物学、基因工程等专业课程的基础上，开设了以水母绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的原核表达、分离、纯化和鉴定为主要内容的生物技术综合大实验。经过不断的实践和探索，我校生命科学学院在综合性设计性实践教学上取得了良好的教学效果。现将我们在教学过程中的体会与同行加以交流，以期抛砖引玉。

1 实验设计
综合性实验指的是实验内容涉及综合知识及方法、手段对学生理论知识、实践能力及思维方式所进行的联合培养。众多的教学研究实践证明，综合性实验是培养学生良好专业技能的有效手段[2]。但如何在有限的教学学时完成基本技能的训练和培养学生的综合科研能力，是教学设计的难点之一。在蛋白质纯化中，多个步骤存在大量的重复性检测工作，使学时的有效性大大降低。为此，把科研中成熟的先进方法和技术充实到实验教学中很有必要。GFP被称为21世纪的显微镜，当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量发射出明亮绿色的荧光。GFP荧光是生物细胞的自主功能，不需要任何外源反应底物即可产生，作为标记物在细胞内可稳定表达并易于观察和检测(LUYOR-3410高强度紫外灯下就可以观察)。其直观的特点可有效克服重复纯化检测步骤与学时的矛盾。生物技术综合大实验以GFP为纯化目标，在传统纯化手段训练的同时，结合标签融合技术的设计，有效对比实验结果让学生体会技术进展对蛋白质纯化的推进作用。

2 实验目的
生物技术综合大实验的目的对本科生来说主要体现在四个方面：
(1)巩固前期所学理论知识。生物技术综合大实验教学内容要紧密结合本科生前期学习的生物化学、分子生物学、基因工程、酶工程等专业科目，培养理论基础扎实，动手能力较强的创新型人才，加深学生对生物技术知识体系的认识；
(2)综合掌握各项生物技术实验的基本技能。综合大实验内容设计上抛弃了以前分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷，将单个实验综合为系统的、连贯的系列型基本生物技术大实验，涉及质粒提取、感受态细胞制备、质粒转化、阳性克隆鉴定、扩大培养及诱导表达、表达蛋白的提取、盐析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、透析及聚丙烯酰胺凝胶电泳等多种技术，使学生接受多种生物技术实验基本技能的训练；
(3)提高发现问题和解决问题的能力。系统性和连贯性是综合大实验的基本特征，前一部分的实验结果即为后一部分的实验基础。前面实验的结果对后面实验的开展及实验的最终结果都具有很大的影响。因此，学生必须积极主动地关注实验的整个过程，对实验中出现的问题要认真分析，找出原因，从而提高分析问题和解决问题的能力；
(4)在学习基本知识和基本实验技能的同时，关注学科前沿技术，体会新技术发展对科学发展的推动作用。

3 实验具体内容及技术路线
为了实现实验设计的目标，我们安排了以下九个分实验：
实验一 细菌培养；
实验二 质粒提取及感受态细胞制备；
实验三 质粒转化及诱导表达；
实验四 硫酸铵沉淀纯化GFP；
实验五 疏水层析纯化GFP；
实验六 离子交换层析纯化GFP；
实验七 凝胶过滤层析纯化GFP；
实验八 亲和层析纯化GFP；
实验九 纯化GFP的SDS-PAGE分析。

4 实验前期准备
4.1 使学生熟悉实验内容和实验相关技术的基本知识
生物技术综合大实验课程内容涉及面广，需要实验室老师和实验课程指导教师以及学生之间的密切配合，才能达到预期目的。对于实验室老师来说，需要准备好综合大实验所必需的各种仪器设备、试剂和耗材，并使各种仪器设备达到良好的使用状态；实验课程指导教师不仅要与实验室老师配合做好各项准备工作，而且要熟悉各种仪器的操作规程，更重要的是指导学生做好实验前期的准备工作；实验实施前一月指导教师要与自己所代班级学习委员提前联系，让学生认真自学本校郭蔼光老师主编的“生物化学实验技术”部分(理论部分)中生物大分子的分离制备、离心技术、层析技术和电泳技术的基本知识，使学生熟悉生物大分子制备前的处理、生物大分子的提取和生物大分子分离纯化的常用方法和技术[5]。同时，使学生熟悉综合大实验的目的和具体内容，并结合学过的相关知识，查阅文献，根据实验要求和提供的条件提出实验方案，对实验方案进行讨论和优化，提交指导教师审阅。

4.2 加强学生科学精神和科学思维的培养
GFP是1962年下村修在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。GFP分子由238个氨基酸残基构成，11个β-折叠，形状呈圆柱形，第65-67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是一种全新的非酶性报告基因，已广泛应用于蛋白质表达纯化、蛋白质相互作用、蛋白质细胞内定位示踪和模式生物转基因等生物学研究中[6-8]。日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔科学家钱永健(RogerY. Tsien)，以其在GFP的发现及发展中所做出的杰出贡献，而共同获得了2008年的诺贝尔化学奖[9]。因此，在实验过程中把学生对GFP发现发展的历史，及其在生物研究中的相关应用的学习和理解作为一项重要内容很有必要。不但能使学生了解GFP的前世与今生，更为重要的是使学生从中学习和领悟科学家的科学精神和科学的思维方式，并融入到自己的学习实践中，提高其创新能力。为此，我们实验实施前两周向学生推荐周程“诺贝尔奖级的科学成就究竟是怎样取得的?——绿色荧光蛋白的发现、表达与开发”和“杰出人才是怎样炼成的？——下村修荣获诺贝尔化学奖案例研究”、张国增等“下村修科研历程的启示”和马三梅等“从绿色荧光蛋白的发现谈如何提出新颖的科研问题”等文章[10-13]，要求学生认真学习写阅读笔记和读后感想。实验前教师进行检查和提问，使学生详细地了解GFP分子的发现、GFP基因的分离与复制、GFP基因的表达、GFP突变体的开发、GFP类似物的筛选与改进的历史进程，了解三位科学家的学术贡献以及加深对GFP的理解，学习GFP发现过程中是如何提出问题以及提出问题所用的思维方式。启发学生运用求异和置换的思维方式来提出新颖的科研问题，并设计实验来回答提出的问题，从而为学生完成综合大实验奠定良好的基础。例如，一位同学在读后感中这样说：“在阅读完文献之后，给我印象深刻的是科学家们在科研道路上所展现的专业精神、奉献精神，这一切的背后都是源于他们对生命的热爱和激情，以及他们探索真理所带有的强烈使命感。GFP的发现、表达与开发的过程说明，你得有一颗耐得住寂寞，一丝不苟，善于观察，细心发现，敢于追根究底的心。在不断失败中依然不气馁，不认输，锲而不舍的精神。当然，缜密的逻辑思维，过硬的专业基础，从不停止的创新意识也是必不可少的。在以后的学习和科研道路上，我会时刻提醒自己做到以上几点，同时，保持一颗年轻跳动永不麻木的心。”另一位同学在读后感中这样说：“科学研究中重要的是提出问题，在实验中出现一个现象时，要想为什么会出现这种现象，通过这种现象又能提出什么新的问题。GFP发现过程中，提出问题所运用求异和置换的思维方式，对于即将步入实验室工作的我们，有着很好的启发作用。”

5 实验实施过程
5.1 实验时间安排
生物技术综合大实验，通常安排在每年春季学期的后半学期，实验周期2周。

5.2 充分发挥学生的积极性和主动性
综合大实验与常规本科实验不同，具有系统性、连续性和协作性，在实验过程中，把班级分若干个实验小组(4人一组)，并选出1名小组组长，负责召集本组同学对实验方案进行讨论，明确组员的分工。鼓励学生根据提供的实验材料和设备，依据所学的基本知识和理论，提出合理可行的实验方案。例如在质粒转化中，既可采用化学转化法，也可采用电击转化法。在化学转化法中，可选择传统的转化方法或快速的转化方法。在GFP分离纯化时，有些组选择阳离子交换，而有些组选择阴离子交换。有些组选择线性梯度洗脱，而有些组选择阶段式洗脱[14]。在实验中GFP需要经过疏水、离子交换、亲和层析和凝胶过滤四次层析纯化，学生针对自己的样品进行自主操作[15]。对实验中出现的问题，要求学生积极思考，查阅相关资料，进行组内讨论，分析原因，提出解决方法。金属螯合亲和层析是近年来出现的一种新型亲和层析技术。相对于传统的分离蛋白质技术，如凝胶过滤层析、吸附层析、离子交换层析等，亲和层析的更大特点是和简便，其通常只需经过一次处理即可快速、简便地使目标蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。通过亲和层析和传统分离蛋白质技术的比较，学生可亲身体验到新技术对分离蛋白质的巨大优势。例如一位同学在实验报告的总结中这样说：“本次实验以GFP为材料，使我们在实验过程中直观地观察到实验的进程，通过对GFP的提取、分离、纯化和鉴定等一系列过程，深入了解了如何对蛋白质进行分离和纯化，巩固了相关理论知识，提高了实验技能，同时也感受到了团队合作的和共享。”
5.3 规范实验操作，认真做好实验总结
先前的单项实验大多是教师首先给学生讲授实验原理、实验步骤和注意事项，然后学生“照方抓药”进行实验操作，学生往往只知其然，不知其所以然。虽然之前学生也做过不少化学和生物化学等实验，但是还有许多学生实验操作不规范，普遍和典型的一个现象就是用完移液管后随意放在实验台面上，而不是放在移液管架上。在实验过程中，对学生不规范的实验操作，教师要及时指出并予以纠正。例如，整个实验过程中，都要用LUYOR-3410高强度紫外线灯监测GFP，了解其在整个实验过程中的变化；在细菌培养、感受态细胞制备、扩大培养过程中要严格无菌操作，防止污染；层析柱的填充要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡，否则要重新装住。平衡和洗脱时，必须保持柱材湿润，不能干柱或裂缝，否则分离纯化将前功尽弃；四次柱层析实验中柱材料一定要严格区分不能相互混用，否则柱子将失效。许多同学在实验报告的总结中都谈到，综合大实验使自己体会到，做任何实验都必须清楚每一步在做什么，为什么这么做。
实验报告是综合大实验课程的重要环节，重点考查学生应用已学习的基本理论和知识，对实验思路、实验结果、实验条件、实验方法和实验技术等做出综合性的系统的总结和分析，提高学生分析问题和解决问题的能力[16]。要求学生按照论文格式完成实验报告，包括以下几部分：封面、正文(文献综述、实验部分)、参考文献、附录(实验的原始数据)。对实验中的异常现象，要依据所学的基本知识和理论进行细致分析，找出原因，并提出改进意见。

6 考核方式
建立以提高学生素质为目标的考核体系，对于调动学生参加生物技术综合大实验的积极性和主动性具有重要的导向作用。为此，我们建立了以平时成绩(实验预习记录、阅读笔记和实验课前提问) 、实验成绩(实验中操作规范、参与程度和实验报告)作为学生综合大实验课程的最终成绩(平时成绩30%、实验成绩70%)。这就督促学生在综合大实验的前期准备和实验过程以及实验报告的各个环节充分发挥自己的主观能动性，积极认真地参与到综合大实验的全过程，通过自己的亲身实践体会科学研究的艰辛和喜悦，提升自己的科学素养和创新能力。例如，2013级生物技术专业2班33名学生考核结果中，总分85分6名(18.2%)，88分4名(12.1%)，90分12名(36.4%)，92分2名(6.1%)，95分9名(27.3%)。课程从2005年开始实施，至今已有12年之久，历经过数轮的课程改革，学生从最初的本院生物技术专业扩展到生物科学专业，从生命学院延伸到本校创新学院。学生评价生物技术大实验课，内容系统完整，理论知识通过实验得到了强化，开阔了眼界，拓展了知识，培养了科学思维和科学精神，大大提高了动手能力及分析和解决问题的能力等综合素质。总之，多年的教学实践证明，生物技术综合大实验使学生的实验操作技能、团结合作的精神、严谨的科学态度、分析问题和解决问题的能力，都得到了很好的训练和提高，是提高学生综合素质和创新能力的有效途径。

 文章作者：李科友*，武永军，刘林丽，刘晶莹，陈 鹏*杨凌西北农林科技大学生命科学学院， 712100