转基因斑马鱼质粒的构建及验证

荧光转基因斑马鱼Tg(ere-vtg：egfp)质粒的构建及验证
随着全球工业化的推进，人们对环境雌激素(environmental estrogens，EEs)的生物影响越来越关注。EEs指能干扰人和生物内分泌活动的具有雌激素样效应的化学物质[1]，主要包括：天然雌激素，如雌激素酮(estrone)、雌二醇(17β-estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)；人工合成雌激素，如17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，EE2)；环境化学污染物，如双酚A(bisphenol A，BPA)、杀虫剂、增塑剂等[2]。EE2是一种常见的EEs [3]，广泛存在于口服避孕药中，其半衰期长且经生物链富集后，在鱼体内的浓度可高于自然水体的数百倍[4]。
EEs主要通过污水排放和地表水径流进入水体环境，其在全世界范围内的污染状况不容乐观[5]。Wang等[6]检测了三峡水库区域的地表水和沉积物中的8种EEs，其中辛基酚、E3和EE2更高检出质量浓度(后简称“浓度”)分别达120、81.6、35.3ng/L。Pelayo等[7]在西班牙河流的天然水体中检出的E2浓度高达130ng/L。Kuster等[8]在巴西里约热内卢地表水中检出366 ng/L的植物性雌激素及47 ng/L的孕激素。上述EEs的低水平、长期、慢性接触，将是新世纪EEs对人体内分泌和生殖健康影响的基本方式。因此，寻找能适应多重机制、直观简便、敏感特异地监测环境中EEs污染程度的检测方法是环境监测领域的当务之急。
斑马鱼(zebrafish，Danio rerio)作为模式生物已在环境毒理学评价中得到广泛的应用[9]。研究表明，在EE2诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)的水平与EE2的浓度呈正相关[10-11]。根据EE2诱导vtg表达这一特点[12]，本科题组构建了由vtg启动子启动报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的Tg(ere-vtg:egfp)质粒[13]。EE2诱导显微注射Tg(ere-vtg:egfp)质粒的斑马鱼表达绿色荧光蛋白，与诱导野生型斑马鱼表达vtg具有很好的一致性，EE2暴露后转基因斑马鱼绿色荧光蛋白的表达即可表示vtg的相应表达[14]，这种稳定传代的Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼，在一定浓度范围(0.1~100 ng/L)内，可以直观方便地动态监测EEs污染情况。

1   材料与方法
1.1   斑马鱼品系及养殖
野生型(AB系)斑马鱼购自斑马鱼国际资源中心(Oregon，美国)，自然产卵后收集胚胎。野生型和Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼的饲养按The Zebrafish Book操作[15]。在部分实验中，为了防止受精后24小时(24 hour post fertilization，24 hpf)的胚胎及后续幼鱼的色素形成，系统水中会加入终浓度为2×10-4 mol/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thio-urea，PTU)。
1.2   Tg(ere-vtg:egfp)质粒的构建及显微注射
以AB系斑马鱼基因组DNA为模板经PCR获取vtg基因编码区上游1.7 kb可能包含启动子的5’非翻译区序列，将39 bp的雌激素反应元件(estrogen response element，ere)经酶切连接到vtg启动子的5’端，将这段融合基因经酶切连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因的表达载体pEGFP-1中。在解剖显微镜观察下，将线性化的Tg(ere-vtg:egfp)质粒显微注射到1~2个细胞期的斑马鱼胚胎中。注射后的胚胎收集培养在含有10 ng/L EE2的孵化液中，每日更换培养液、挑出死亡胚胎并在荧光显微镜下观察。

1.3   转基因斑马鱼系的建立
经10ng/L EE2暴露1周后，筛选绿色荧光阳性的嵌合体，在系统水中饲养至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，其后代继续以10ng/L EE2暴露一周，挑选有绿色荧光出现的F1代，喂养至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，继续进行繁殖遗传筛选，直至得到与野生型斑马鱼交配产生的Fn代出现有荧光，提示Fn-1代斑马鱼被确定为纯合子。由此建立Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼系，并继续组内交配传代。

1.4   暴露实验
1.4.1   敏感性鉴定实验
将转基因斑马鱼纯合子幼鱼置于盛有1 L EE2溶液的鱼缸中暴露1周。暴露组浓度分别为100、10、1 ng/L(EE2)，溶剂对照为5 μL/L乙醇。随机放入100个胚胎/缸。为了避免EE2被幼鱼吸收或水分蒸发导致的暴露浓度改变，每天更换EE2溶液和乙醇溶液。分别在暴露后60、72、84、96、108、120、144 h时，计数表达绿色荧光蛋白的幼鱼数量并计算百分比，重复3次实验。纯合子转基因斑马鱼的胚胎暴露实验方法与上述方法相同，根据各暴露组出现绿色荧光的时间，进行持续观察，并在出现绿色荧光时拍照记录。

1.4.2   特异性鉴定实验
雌激素衍生物或活性类似物有很多种，包括E2、己烯雌酚(diethylstilbesterol，DES)、E3、氯化镉(cadmium chloride，CdCl2)、玉米烯酮、BPA。另外，除上述EEs外，课题组还购买了雌激素结构类似物(同为甾体类固醇激素的孕酮和皮质激素17-羟固醇)。每种物质均配制1×108、1×107、1× 106、1×105、1×104、1×103、1×102、10、1 ng/L浓度的溶液，每种物质低浓度向高浓度依次进行转基因斑马鱼幼鱼暴露试验，连续7 d，每天更换暴露溶液后观察绿色荧光，直到观察到绿色荧光蛋白表达为止，更高浓度不做检测。

1.5   显微镜观察和成像
使用配备GFP过滤器且具有DP70数码相机的SZX12显微镜(Olympus，日本)观察斑马鱼的胚胎、幼鱼和成鱼并拍照。

1.6   逆转录PCR检测vtg表达
根据Trizol试剂盒(Invitrogen，美国)的说明书分别提取样品成鱼肝脏或幼鱼全鱼的总RNA。用oligodT引物和M-MLV逆转录酶(Promega，美国)逆转录合成cDNA。以此cDNA为模板，用引物(vtg1F：5’-GTTCAACCTTGTTCCCGAG-3’和vtg1R：5’-GATCC ATAAGCTTCATCAGG-3’)进行PCR，检测vtg1基因的表达水平。以ELF1α的特异性引物(F：5’-CTTCGTC CCAATTTCAGGAT-3’；R：5’-CAGAGACTCGTGGTGC ATCT-3’)作逆转录PCR的上样量对照。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳。

1.7   统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计分析。各组GFP表达量比较采用方差分析法分析，vtg蛋白含量比较及其基因条带光密度比值的比较采用Kruskal-Wallis H法。检验水准α=0.05。

2   结果
2.1   转基因斑马鱼系的建立
对8 000个胚胎显微注射Tg(ere-vtg:egfp)质粒后，经EE2暴露，有GFP表达的性成熟的嵌合体转基因斑马鱼共119条。其中，仅有1条可将egfp基因遗传给下一代，即生殖系嵌合体转基因斑马鱼，嵌合子F0代，其与野生型斑马鱼杂交得F1代；经EE2暴露，GFP表达比例低于1%。饲养至性成熟的F1代与野生型斑马鱼杂交得50%杂合子的F2代；经EE2暴露并进行荧光筛选后，共183条(雌性101条，雄性82条)可杂交并生育后代(F3代)。F3代经EE2暴露并进行荧光筛选后，挑选产卵较好的斑马鱼(雌性78条，雄性88条)为纯合子筛选对象(图 1)；最终，共挑选出10对纯合子作为种鱼，交配产卵供后续的敏感性鉴定和特异性鉴定。10 ng/L EE2暴露时野生型和Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼的GFP表达见图 2。另外，研究发现，经EE2暴露后表达GFP的幼鱼，换入系统水饲养2周左右后，GFP表达量明显减少，部分斑马鱼幼鱼GFP表达消失，说明EE2诱导Tg(ere-vtg:egfp)转基因鱼GFP表达具可逆性。

2.2   敏感性鉴定
EE2诱导Tg(ere-vtg:gfp)转基因斑马鱼幼鱼表达GFP与浓度、时间有关。时间相同时，GFP在幼鱼中的表达率可随暴露浓度增加而增加(P＜0.05)；浓度相同时，暴露时间越长，GFP的表达率越高(P＜0.05)。由图 3可见，当EE2暴露浓度为1 ng/L时，96 hpf前无幼鱼出现GFP表达，暴露时间分别为108、120、144 h时，表达GFP的幼鱼分别占总数的2.6%、4%、6.3%。当EE2暴露浓度为10 ng/L时，表达GFP幼鱼的比例随时间增加(60~120 h及144 h)而增加，分别为2.0%、4.7%、7.3%、11.3%、14.0%、17.6%、24.7%。当EE2暴露浓度为100 ng/L时，表达GFP幼鱼的比例随时间增加而增加，分别为17.3%、42.6%、58.7%、70.3%、73.8%、76.6%、77.3%。结果显示，本课题组构建的转基因斑马鱼在EE2 100 ng/L水平有急性响应。在较低浓度时也具有反应性，但需较长时间。

2.3   特异性鉴定
选择包括E2、E3、DES、玉米烯酮、酚类代表性化学物BPA、金属类代表物CdCl2在内的雌激素衍生物或活性类似物，以及雌激素结构类似物即同为甾体类固醇激素的孕酮和皮质激素17-羟固醇作为受试物，用Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼幼鱼进行暴露试验，观察是否能诱导出现荧光。

由图 5可知，各组的10条斑马鱼均出现肉眼可见荧光的浓度分别为：在100 ng/L浓度组E2和DES，1 000 ng/L的E3暴露组，1×104 ng/L的CdCl2暴露组，1×105 ng/L的玉米烯酮暴露组，1×106 ng/L的BPA暴露组。然而，结构类似物孕酮和17-羟固醇在各浓度均没有GFP表达，故未放入图中进行比较。上述结果提示，Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼有可能是水体EEs污染的活的监测器。

3   讨论
转基因斑马鱼是指在鱼体内转入一些DNA片段，这些片段是特定化学物的效应元件，能使鱼对特定毒物更加敏感，提高灵敏度。Carvan Ⅲ等[16]利用转基因斑马鱼的某些效应元件可显示接触的特定毒物。转基因斑马鱼的DNA片段含芳香烃、亲电子物质、金属以及雌激素的效应元件，每个效应元件结合一个报告信号如荧光素酶基因或绿色荧光蛋白。在斑马鱼的细胞系中带有报告基因的效应元件也已研制成功[17]。Lee等[18]构建了一种新颖敏感的转基因斑马鱼模型，当暴露于环境雌激素，可以诱导包括肝脏、心脏、骨骼肌、前脑神经等靶组织的GFP表达，以此实时评估对生物体的综合健康影响。

斑马鱼的vtg已经成为检测环境雌激素的核心标志[19-20]。正常情况下，vtg在幼鱼或雄鱼体内含量较低，难以检测得到，但在环境雌激素诱导下，雄鱼和幼鱼可出现vtg表达[21]，而且vtg1的mRNA水平比其他亚型高得多，且其表达水平和EEs的浓度呈正相关性[11, 22]。Muncke等[23]建立了用斑马鱼胚胎检测vtg表达水平的MolDar T检测方法，综合了体内外检测方法的优点，并使检测更为简便准确。但是，这种方法需要将鱼处死，不适合水环境中动态观察。本研究利用vtg的特点，经过遗传筛选，构建了一种Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼系模型。在其体内，由vtg基因的启动子来调控报告基因GFP的表达。为了增强斑马鱼监测EEs的敏感性，我们在启动子前插入雌激素反应原件ere顺式作用元件，这种转基因斑马鱼只对EEs活性的物质发生响应并能更灵敏地表达GFP。

本研究对典型的雌激素类化合物EE2进行了敏感性研究。当EE2浓度大于1 ng/L时，可见转基因斑马鱼幼鱼呈现明显的GFP表达。当EE2浓度大于0.1 ng/L时，可见转基因斑马鱼胚胎呈现明显的GFP表达。此结果与Islinger等[24]在成年雄性斑马鱼试验显示的vtg和ER-α基因在3、10、30ng/L EE2组中有明显表达的结果相一致。Bogers等[25]将具有雌激素反应的转基因斑马鱼暴露于不同浓度的EE2，观察荧光出现的时间，结果显示3 ng/L和10 ng/L EE2可在30 hpf诱导GFP表达。与之相比，本研究中Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼的敏感性较高。特异性研究结果表明，Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼能直观地检测水中的雌激素，对于上文提及的甾体类固醇激素如孕酮和皮质激素17-羟固醇，虽与雌激素结构类似但不能诱导vtg表达，其浓度高达100 mg/L时也不能诱导转基因斑马鱼表达GFP。

综上所述，转基因斑马鱼Tg(ere-vtg:egfp)对EEs的识别是依据雌激素样活性，说明其对EEs的识别与检测具有很好的敏感性、特异性和普适性。更重要的是，这种Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼用于水环境监测可以实时动态地发现雌激素污染程度的变化。若用相同的思路和技术，可以应用于构建其他转基因斑马鱼来监测各种环境污染物，比如将vtg1启动子替换成其他污染物敏感的启动子。已有报导，Xu等[26]构建了转基因斑马鱼(cypla:gfp)在体检测水体中二噁英类污染物，主要诱导肝、肾和肠道的GFP表达；Matz等[27]利用hsp70启动子构建的转基因斑马鱼来检测金属离子镉。同时，该转基因技术也可用于环境雌激素作用机制的研究。

根据本研究结果，作者认为，这种荧光转基因斑马鱼是名副其实的“生态灯泡”，充当成千上万个受污染物威胁的饮水源的活的监测器。这种转基因斑马鱼与理化分析手段相比，其检测EEs速度较快(只需2 min，而大多数传统的检测方法需2 d)，而且检测可在活体胚胎内直接进行。此外，还能观察到连续暴露于EEs的整个生命过程。这将有助于把斑马鱼同一个体早期胚胎细胞直接与其后的生理、行为的其他观察终点联系起来，具有直观、客观、综合和历史可追溯性等特点，可反映环境污染的客观状况。总之，随着各种环境污染物转基因斑马鱼研究和应用的深入，它们将在EEs环境监测和危险度评价领域中发挥重要作用。