水稻转基因实验操作手册

水稻转基因实验操作手册

愈伤组织诱导
(1) 选取饱满、无霉斑的成熟水稻种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用70%的乙醇处理1 min，不时摇动；
(2) 用无菌水冲洗3遍，每次30 s，不时摇动；
(3) 用0.1%升汞溶液消毒12 min，不时摇动；
上述步骤可以在超净工作台外面操作，在第（3）步快结束时，用酒精棉球将装有消毒种子的小三角瓶擦拭干净后拿到超净工作台上。
(4) 用无菌水冲洗5遍以上，每次30 s，不时摇动；
(5) 将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后用无菌镊子夹到诱导培养基上；
(6) 28℃，暗培养4周以上。

准备工作：
① 超净工作台的消毒：
清除台面 → 75%乙醇喷雾超净工作台→ 75%的酒精棉球擦拭超净工作台面→ 将接种所用物品用酒精棉球擦拭干净后放在台面上（酒精灯，打火机，已灭菌镊子，无菌水1瓶，已灭菌的大玻璃杯1个（盛废液），已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子），盛诱导培养基的平皿若干，铺有灭菌滤纸的平皿一个））→ 打开短波紫外线灯杀菌20-30 min，然后打开鼓风机和工作电源，关闭紫外灯，5 min后接种；
② 接种人员首先用洗洁精洗净双手后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。如有可能，将胳膊做同样消毒处理。
注意事项：
① 在接种过程中要经常灼烧镊子，防止交叉污染；
② 尽量在酒精灯下风向的一小块无菌空间操作，尽量避免在接种材料的上层空间活动；
③ 接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
④ 培养瓶上贴上标签，标明接种材料和日期；
⑤ 无菌水需准备2瓶，一瓶在超净工作台外面使用，另一瓶在超净工作台里面使用；
⑥ 若接种材料出现污染，及时转接培养基。
附注：2 d后水稻种子开始萌发，7-10 d即从盾片处产生小块愈伤组织，2 周左右愈伤进一步膨大，此时愈伤组织质地较硬，成块状，淡黄色。

愈伤组织继代培养
挑选颜色鲜亮、紧实且干燥的胚性愈伤（即散落到培养基上的愈伤，不要选从种子上发出来的愈伤），放于继代培养基上暗培养2周，温度28℃。

预培养
挑选紧实且干燥的胚性愈伤，放于预培养基上暗培养4-14 d（不超过2周），温度28℃。

农杆菌侵染
(1) 在低温（4℃或-80℃）保存的农杆菌，划线培养活化一次，再预培养2天。然后转移至装有悬浮培养基的离心管里，涡旋振荡重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至OD600大约为0.8-1.0；
(2) 挑选颜色鲜亮、紧实且干燥的胚性愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；
(3) 加入农杆菌悬浮液，浸泡愈伤30 min；
(4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上，超净工作台上吹干（1 h以上）；
(5) 然后将愈伤放置在已铺有一层滤纸的共培养基上20℃培养3 d。
准备工作：酒精灯，打火机，灭菌镊子，共培养基，悬浮培养基，灭菌三角瓶一个，铺有灭菌滤纸的平皿一个，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

选择培养

使用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源将阳性的愈伤筛选出来；
如果没有LUYOR-3415RG,按照以下步骤筛选：

(1) 将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；
(2) 用灭菌的蒸馏水充分洗涤愈伤；
(3) 将愈伤浸泡在含400 mg/L羧苄青霉素的灭菌水中30 min，不时摇动；
(4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干水分，并在超净工作台中晾干（约3h）；
(5) 转移愈伤至含有50 mg/L选择培养基上选择培养2次，每次2周（次羧苄青霉素筛选浓度为400 mg/L，第二次为250 mg/L）。
准备工作：酒精灯，打火机，灭菌镊子，灭菌水1瓶，选择培养基，灭菌三角瓶2个（一个用来装愈伤，另一个用来配含400 ppm羧苄青霉素的灭菌水），铺有灭菌滤纸的平皿一个，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子），已灭菌的大玻璃杯1个（盛废液）

分化培养
将阳性或抗性的愈伤转移至分化培养基上，光照下培养，温度28 ℃。

生根培养
剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中，光培养2周以上，温度26 ℃（转移至生根培养基上，1-2 d就能长出新根）。
准备工作：酒精灯，打火机，灭菌镊子，灭菌剪刀，生根培养基，已灭菌的小玻璃杯1个（盛95%酒精，用于消毒镊子）

移栽
待苗高10 cm左右，根系发生较好，打开瓶盖，向瓶内注入无菌水，炼苗2 d后，洗掉根上的残留培养基（注意不要伤根），移栽。在最初的几天，蒙上保鲜膜，避免强光照射，保持水分湿润。