DsRED 红色荧光蛋白植物表达载体的构建和表达

DsRED 红色荧光蛋白植物表达载体的构建和表达

为获得红色荧光蛋白(Red fluor escent pro tein, RFP)真核表达载体35S-pC1301-DsRED, 利用PCR 将瞬时表达载体PGDR 上的全长DsRED 扩增下来并用Xba Ⅰ 和Bam H Ⅰ 酶切该片段, 同时用相同的内切酶消化中间载体pBluescript SK(+), 连接两片段并测序, 将鉴定正确的DsRED 用相同的内切酶切下并导入双元载体35SpC1301, 利用基因枪将正确质粒转染洋葱内表皮细胞瞬时表达DsRED。结果表明:35S-pC1301-DsRED 真核表达载体已成功构建并在荧光共聚焦显微镜下呈现红光, 即获得了可产生红色荧光的35S-pC1301-DsRED 载体,为今后植物目的基因定位提供了阳性对照, 同时中间载体pBluescript SK(+)-DsRED 的构建为今后植物目的基因定位提供了实验工具。
　红色荧光蛋白RFP(Red f luo rescent pro tein)是从印度太平洋与海葵相关的Discosomasp 中分离得到的一种生物发光蛋白, 它能在紫外线激发下发出红色荧光。RFP 的激发波长和发射波长较长, 其更大激发波长为558 nm , 更大发射波长为583 nm ,且发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外。
近年来, 随着荧光蛋白多样性在红色光谱范围内的发现[ 2] , 不同形式的DsRED 相继用于细胞分子生物学的研究 。这些蛋白可与GFP 一起应用于双重标记实验或在转基因植物中作为一个单独的报告基因。报告基因(Repor ter gene)技术是将一段顺时调控序列插入报告基因上游以控制报告基因的表达, 从而直观地“报道”该顺时调控序列的表达调控以及与其相关信号转导通路的活动。到目前为止, 本实验室获得的红色荧光蛋白是在PGDR 载体上的DsRED[ 7] , 因PGDR 为单元载体不能应用于转化真核生物材料, 不利于直观形象的研究生物体内的基因功能, 为此将DsRED 导入中间载体和双元载体, 这对于今后研究生物体内目的蛋白的功能提供了一种新的实验工具。

本研究旨在构建PGDR 载体上的DsRED , 用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 双酶切DsRED 序列并导入双元载体35S-pC1301 , 最终构建成35S-pC1301-DsRED双元表达载体, 并观察构建后的35S-pC1301-DsRED 在洋葱内表皮细胞中的瞬时表达情况, 从而为进一步利用DsRED 作为报告基因奠定了基础。

1 　材料与方法
1 .1 　材料
1 .1 .1 　菌株与质粒　pBluescript SK (+)质粒(Promega)35S-pC1301[ 8] ;DH5α(上海闪晶分子生物公司);含有DsRED 片段的pGDR 质粒[ 7] 。
1 .1 .2 　试剂和仪器　PCR 引物;Genclean 柱式琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒抽提试剂盒;Marker 、高保真Taq DNA 聚合酶、dN TP 、限制性内切酶X ba Ⅰ和BamH Ⅰ 、T4 DNA 连接酶、T4 连接buf fer 、氨苄霉素(AMP)及卡那霉素(Kan)等。PCR 仪(Eppendo rf );电泳仪(Tano nEPS100);水平电泳槽);基因枪(Bio -Rad PDS -1000);激光共聚焦荧光显微镜(ZEISS LSM510 ME TA)。
1 .2 　方法
1 .2 .1 　PCR 扩增及片段回收　运用DNAS TAR软件根据DsRED 序列设计引物, 分别引入X ba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切位点, 所用引物:DsRED-F5′-TCTAGAGCCA TGGCCTCCTCCGAGAA-3′;DsRED-R 5′-GGA TCC T TACAGGAACA GG TGGTGGC-3′(下划线处为引入酶切位点X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ )。以pGDR 质粒为模板进行PCR,DsRED-F 和DsRED-R 扩增DsRED 序列, 琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后, Genclean 柱式琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的片段, 利用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切该片段。试验中PCR 的反应条件为:94 ℃预变性为3 min , 94 ℃变性30 s , 58 ℃退火1min , 72 ℃廷伸45 s , 共35 个循环, 72 ℃充分延伸10 min 。PCR 产物用内切酶消化3 h , 酶切完成后用1 %的Ag arose 凝胶电泳验证该酶切产物。
1 .2 .2 　大肠杆菌培养　感受态细胞的转化, 质粒提取, 鉴定等按分子克隆实验指南2000 版进行。
1 .2 .3 　中间载体pBluescript SK(+)-DsRED 的获得　利用T4 DN A 连接酶将X ba Ⅰ 和B amH Ⅰ 消化的PCR 产物与pBluescript SK(+)连接, 4 ℃过夜后转化DH5α, 在含AMP 抗性的LB 固体培养基平板上37 ℃培养16 h 后有白色菌落长出, 挑取菌斑在含有AMP 抗性的LB 液体培养基内培养, 其OD 值约为1.2 ～ 1.4 左右后, 试剂盒提取质粒, 用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 进行双酶切鉴定, 1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后, 送公司测序。
1 .2 .4 　35S-pC1301-DsRED 质粒的获得　将鉴定正确的pBluescript SK(+)载体上的DsRED 序列与载体35S-pC1301 同时用X ba Ⅰ和Bam H Ⅰ双酶切后利用T4 DNA 连接酶对其进行连接, 将上述连接产物转化DH5α, 在含有Kan 抗性的LB 固体培养基平板上37 ℃培养16 h 后有白色菌落长出。挑取单菌落在含有Kan 抗性的LB 液体培养基内过夜培养, 其OD 值约为1.2 ～ 1.4 左右后, 用试剂盒提取质粒, 利用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 进行双酶切, 1 %琼脂糖凝胶电泳验证该酶切产物。
1 .2 .5 　35S-pC1301-DsRED 瞬时表达与观察　洋葱内表皮细胞中35S-pC1301-DsRED 蛋白瞬时表达参照Col ling s 等 。基因枪转化操作参照Bio-Rad 操作手册进行(PDS-1000/He), 压力选择范围在1 100 -1 300psi 之间。样品在激光共聚焦显微镜(Zei ss LSM510 ME TA)上观察和拍照。激发波长设置:RFP 543 nm 。

2 　结果与分析
2 .1 　PGDR 载体上目的片段DsRED 的获得在PGDR 载体上DsRED 序列的两端设计引物DsRED-F 和DsRED-R , 同时两条引物中分别引入酶切位点X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 。
以pGDR 质粒为模板进行PCR , 扩增出680 bp的DsRED 片段, 琼脂糖电泳鉴定正确后(图1),Genclean 柱式琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的片段, 将回收的PCR 产物用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 进行酶切, 消化完全后, 电泳并割胶回收目的片段。

图1 　PGDR 载体上PCR DsRED 结果

2 .2 　中间载体pBluescript SK(+)-DsRED 的导入及鉴定
用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 消化pBluescript SK(+)中间载体, 消化完全后, 同样利用试剂盒将切开的载体片段进行电泳回收(图2)。将用相同双酶切的PCR 产物和pBlue script SK(+)中间载体利用T4DNA 连接酶进行连接, 转化DH5α, 获得含有目的片段的克隆, 即pBluescript SK(+)-DsRED , 利用X ba Ⅰ 和B amH Ⅰ 对其进行酶切验证(图2), 两片段长度分别是pBluescript SK(+)3Kb 和DsRED680 bp 左右, 电泳验证酶切片段后, 送公司测序, 测序结果正确。

图2 　SK(+)空载体酶切及重组载体SK(+)-DsRED 酶切鉴定

2 .3 　双元载体35S-pC1301-DsRED的获得及鉴定
用X ba Ⅰ 和BamH Ⅰ 消化双元载体35SpC1301, 通过凝胶电泳回收获得11 Kb 左右的DNA 片段(图3), 同时, 将目的片段DsRED 用相同的酶从鉴定正确的pBluescript SK(+)-DsRED 上切下, 利用T4 DNA 连接酶进行连接, 转化DH5α,获得含有目的片段的克隆, 即35S-pC1301-DsRED ,用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切验证, 两片段长度分别是11 Kb 左右和680 bp 左右, 电泳验证酶切片段正确(图3), 即获得了35S-pC1301-DsRED 双元载体。

图3 　双元载体35S-pC1301 酶切及重组载体
        35S-pC1301-DsRED 酶切鉴定

2 .4 　转染洋葱细胞后35S-pC1301-DsRED 的瞬时表达
利用基因枪转染法将35S-pC1301-DsRED 质粒转染洋葱内表皮细胞, 28 ℃ 24 h 黑暗培养后在荧光共聚焦显微镜下进行观察, 在543 nm 激发光下有发明亮红色荧光的洋葱表皮细胞出现(图4CD),而对照空载pC1301-35SN , 在荧光共聚焦显微镜下无红色荧光细胞产生(图4A-B)。从而获得可产生红色荧光的35S-pC1301-DsRED 载体, 说明可产生红色荧光的35S-pC1301-DsRED 载体已被成功构建。

图4 　重组载体35S-pC1301-DsRED转染洋葱内表皮细胞

3 　讨论与结论
DsRED 是一种生物发光蛋白, 因其红色荧光有较强的穿透力, 作为报告基因已被广泛应用于动物、植物和酵母等真核生物 。它在激发波长为543nm 的条件下, 不需加入任何底物就可以发出红色荧光, 所以DsRED 可以作为一种新型的报告基因来研究植物、动物细胞基因的表达与调控以及蛋白定位、转基因植物的亚细胞定位等方面的研究。
DsRED 具有很高的消光系数和荧光量子产量,这些特性表明, DsRED 发射荧光的强度要比罗丹明B 等染料和更好的GFP 突变体的强度高得多, 其抗漂白能力强于GFP 及其黄色荧光突变株, 以及增强型绿色荧光蛋白(GFP)和增强型黄色荧光蛋白(CFP)。另外, DsRED 对pH 值不敏感, pH 值为4.5 ～ 12 时仍保持稳定, 这使其使用范围更加广泛。RFP 穿透性强且持续时间长, 在原核生物中成功地实现了DsReD2 的融合表达, 且不需要特殊的激发光源即可在日光下观察到较强的红色荧光[ , 比观察GFP 更加方便。
本研究所应用的转基因方法简单、效率高、易成功。pBluescript SK(+)-DsRED 的构建是基于中间载体pBluescript SK(+)的MCS 含有较多的限制性内切酶位点, 为以后DsRED 作为报告基因和植物目的基因同时导入植物体进行直接研究提供了很好的工具, 同时为目的基因进行DsRED 和GFP共定位提供了很好的中间载体, 可使目的基因定位更加准确。本研究对PGDR 、35S-pC1301 进行构建, 获得了35S-pC1301-DsRED 真核表达载体并成功转染洋葱内表皮细胞, 在荧光共聚焦显微镜下发现细胞可呈现明亮的红色荧光。35S-pC1301-DsRED 克隆转染洋葱内表皮细胞具有稳定性好、荧光持续时间长、不破坏细胞结构及直接观察等优点,为构建高表达载体在植物亚细胞定位方面开辟了一条新途径。

论文作者：董伟欣，河北农业大学农学院，张迎迎 中国科学院上海植物生理生态研究所

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