农杆菌介导的植物遗传转化方法

农杆菌如何介导植物遗传转化？
植物遗传转化技术
植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。

农杆菌介导的优点
农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。

农杆菌介导的原理
农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。在自然环境中，被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。

图1 农杆菌介导的基因转化。
此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。改善植物受体以提高较难转化的植物物种的转化效率是目前研究的主要方向之一。

生物学过程
农杆菌介导的植物遗传转化是个复杂的生物学过程，主要包括以下l0个步骤：
1. 受伤植物组织释放酚类化合物引发农杆菌的识别和附着；
2. 农杆菌VirA和VirG蛋白组成信号转导系统诱导植物产生应答信号；
3. Vir基因区的活化；
4. VirD1/D2蛋白复合体复制T-DNA产生T-链；
5. 几种Vir蛋白共同作用使VirD2-DNA复合体(未成熟的T-DNA复合体)进入受体细胞细胞质；
6. VirE2与T-链结合形成成熟的T-DNA复合体，并穿过受体细胞质到达细胞核；
7. T-DNA复合体通过主动运输由核孔进入受体细胞核；
8. T-DNA复合体可能通过V1P1与寄生染色质间的互作而靶向目标整合位点；
9. T-复合体除去护卫蛋白；
10. T-DNA整合进入受体基因组，T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似，因此可以在植物细胞中表达。

农杆菌介导的转化效率影响因素
事实上，农杆菌介导的遗传转化有两个关键过程：农杆菌侵染转化材料及转化材料的再生。各种因素对于转化效率的影响都可以归于对这两个过程的影响，主要包括以下几个方面：

1. 农杆菌菌株。农杆菌作为植物基因转化的工具，其属性对转化的成功有决定性的影响。农杆菌依其代谢冠瘿碱的种类可分为章鱼碱型、农杆碱型、胭脂碱型和琥珀碱型等类型，不同的菌种会影响基因转化的效果。
2. 外植体类型。外植体类型是转化的主要影响因素。不同来源和发育状态的受体都会对农杆菌的侵染产生很大影响。外植体的类型有很多种，如根、茎、芽、子叶、胚胎等，其分生组织细胞完成转基因后必须能从转化处理造成的冲击恢复并快速再生植株，根据试验目的及意义选择合适的材料。
3. 培养基组成。培养基组成包括糖含量、盐浓度、生长调节剂和一些化学物质的加入等，对转化效率有巨大影响。
4. 筛选标记基因。由于在植物基因转化中，外源基因稳定的整合频率低，因此如何选择适当的筛选标记，以有效地分离转化与非转化细胞，且不干扰细胞的正常生长，也不干扰再生植株的产生，是转化成功的重要环节之一。

农杆菌介导的应用
遗传转化是植物分子育种的关键技术，主要目的是将目的基因导入现有基因组中产生具有优良性状的物种，同时保持植物的遗传特性。农杆菌介导的遗传转化已被用于生产各种有用蛋白质如重组抗体和可食用疫苗等。因此，农杆菌介导遗传转化在基因植物领域具有广阔应用前景：

1. 生物监测与解毒。有些植物已被设计成生物修复和监控仪，用来检测环境中有毒化合物的存在并对污染土壤和地表水进行解毒。目前，通过农杆菌介导的遗传转化技术对印度芥菜进行改造实现了炼油厂废水中常见污染物亚硒酸钠的合理处理，对烟草进行定向改造促进了炸药中三硝基甲苯的降解。
2. 提高作物产量。农杆菌介导遗传转化的应用已经使作物产量显著提升。同时，通过引进各种毒素基因包括最常见的Bt毒素基因到棉花、玉米、马铃薯、烟草、水稻等作物中已生产出抗虫作物。
3. 提高作物营养价值。对粮食作物的遗传修饰为改善和提高食品营养成分提供可能。农杆菌介导遗传转化已经用于提高作物营养价值的几个方面，包括提高大豆、油菜和玉米中β-胡萝卜素含量；改善油料作物油成分和含量；减少水稻中维生素A缺乏症并开发“金稻”。