农杆菌转化拟南芥

农杆菌转化拟南芥
1．农杆菌感受态制备
① 从 YEB 平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于 5 mL YEB （含 50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；
② 取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至 OD 达到 0.5；
③ 菌液冰浴 30 min，转至预冷的 50 mL 离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；
④ 2 mL 预冷的 50 mM 无菌 CaCl2 溶液（含 15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以 100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC 冰箱，备用。

2．质粒转化农杆菌感受态
① 吸取构建好的表达载体质粒 5 µl，加入到 100 µl 感受态细胞中，混匀；
② 冰浴 30 min，液氮冷冻 5 min，37ºC 热击 5 min；
③ 加入 800 µl YEB 液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养 5 h；
④ 离心，留 200 µl 上清重悬沉淀，将菌液涂于 YEB 固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC 培养 2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC 保存，用于下一步植物转化。

3．农杆菌侵染拟南芥花序
① 将筛选的阳性农杆菌在 YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑 3-5 个单克隆，于 5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，
200 rpm 培养 16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL 的培养基中，培养 16 h 以上；
② 5000 rpm 离心 20 分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加 50 g/L 的蔗糖，调 pH 为 5.8 左右，然后加 200 ul/L 的 Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；
③ 在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约 1 分钟，然后用保鲜膜
完全包裹以保湿，放回培养室 12 小时以上打开保鲜膜；
④ 待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。

4．拟南芥转基因苗筛选
① 种子消毒：用 75%的酒精添加 0.1%的 Triton X-100 在 1.5 mL 的离心管中摇晃 15 min，然后在超净台中用 95%的酒精洗两次，最后一次直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，滤纸直接放在超净台上，吹干种子（30min 以上），然后把滤纸对折，左手捏着一角，右手拿一把镊子轻轻敲击滤纸把种子均匀撒到筛选培养基上；
② 抗性苗筛选：MS 培养基中加 25 mg/L 的氨苄青霉素，抑制细菌的生长；根据质粒抗性，在培养基中还得加 20 mg/L Basta 或 25 mg/L 潮霉素。筛选培养 15 d 左右，把阳性苗转移到土中，用透明的薄膜盖 3 d 左右以保湿；
③ PCR 鉴定：提取抗性苗 DNA，外源基因特异引物检测基因整合情况；
④ 荧光定量 PCR 分析：提取抗性苗 RNA，外源基因特异引物检测基因表达情况。