荧光素酶在蛋白质相互作用研究中的应用

蛋白质相互作用参与细胞的多项生理活动,如信号转导、基因表达调控、核转运、膜泡运输、细胞迁移。它们既可调节生物体生长繁殖、新陈代谢、以及细胞的凋亡与坏死等过程[1] ,也能介导肿瘤、神经退行性变、病毒感染等多种疾病的发生与发展。在生命科学领域,对蛋白质相互作用的研究日益广泛,受到更多重视。多种生物化学方法如蛋白质片段互补、共振能量转移、免疫共沉淀、酵母双杂交、下拉实验等可用来观察蛋白质相互作用。此外,一些生物物理方法,如表面等离子共振、等温滴定量热法、核磁共振、质谱等也常用于该领域的研究。采用化学发光特别是其中的生物发光技术应用于上述生物化学方法,具有独特的优势。
1　化学发光与生物发光
化学发光通常指物质在常温下发生化学反应时伴随的发光现象,实质为反应过程中生成的激发态化学产物在跃迁到基态时产生光辐射[2] 。将化学发光作为检测信号在实际应用中具有许多优势。,化学发光,特别以生物发光为代表,理论上其反应产生的每1 个激发态产物都会释放1 个光量子,具有很高的能量转移效率(量子产率)。利用光电倍增管可实现单光子计数,灵敏度极高。第二,在体内和体外的反应体系中,均不存在内源的化学发光,因此背景噪音极低。第三,化学发光反应中的能量-光量子偶联的性,决定了产生的光信号线性变化区间极宽。利用的监测手段,可获得理想的检测范围。第四,高灵敏度的化学发光检测可以在短时间内完成,具有快速、的优势。第五,这种高度灵敏的特性使微量检测成为可能,结合其快速简便的优点,适于进行高通量筛选。第六,采用化学发光检测获得即时信号,可动态监测反应进程。第七,检测光强度的仪器简单,仅需光电倍增管或光电二极管以及相关转换记录信号的电子元件,而不需要激发光单元,易于进行自动化设置。化学发光检测因具有上述优势而广泛应用于临床检验、医药研发、环境监测、法医鉴定、反恐及军事领域。生物发光属于化学发光的范畴,可见于一些特定的细菌、真菌、昆虫、植物和海洋生物等种属中。生物发光过程是由酶催化的化学反应。催化生物发光反应的酶统称为荧光素酶(luciferase),其反应底物统称为荧光素(luciferin)。常见的生物发光反应可以分为3 类,如Fig.1。

萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, FLuc)催化分子氧对其特异底物D-荧光素(D-luciferin) 的氧化,并由ATP 提供能量发生化学发光反应;Mg2+ 作为必需的辅因子维持酶的活性[3] 。FLuc 催化的发光反应分为两个步骤:第1 步为底物与ATP 反应生成腺苷化中间产物;第2 步为中间产物与氧气反应生成二氧化碳并伴随发光。细菌荧光素酶(LuxAB)的催化反应同样分为两步[4] :第1 步,与LuxAB 结合的还原型黄素单核苷酸( reduced flavin
mononucleotide, FMNH2),经O2 氧化生成中间产物过氧化黄素;第2 步,过氧化黄素与底物长链脂肪醛反应生成脂肪酸,并伴随发光。以海肾荧光素酶(Renilla luciferase, RLuc)为代表的多种海洋荧光素酶可催化腔肠素(coelenterazine)的氧化。该反应不需要ATP 及其他辅因子的参与,直接氧化底物产生化学发光。
在研究体系中,多数荧光素酶催化的生物发光具有闪光型(flash-type)的动力学特征,发光强度通常仅维持数分钟,随后迅速衰减;只有个别的荧光素酶产生辉光型(glow-type)的生物发光,光信号半衰期可达数十分钟甚至数小时。通过反应体系的优化、酶或底物的分子改造,可以将闪光型生物发光转变为辉光型,从而满足不同的研究需求。基于几种荧光素酶的生物发光检测技术,近年来已成为这一领域的研究热点。
2　常见荧光素酶及其特性
2. 1　萤火虫荧光素酶
早在1885 年,在昆虫中就发现了萤火虫荧光素酶(FLuc)[5] 。上世纪80 年代,克隆了FLuc 的编码基因,并在大肠杆菌中成功表达[6] 。不同萤火虫来源的FLuc 可能存在一些差异。最常用的北美萤火虫(Photinus pyralis) 来源的荧光素酶,是含有550 个氨基酸残基的单体多肽链,分子量为62 kD。该酶催化ATP 依赖的化学发光反应,发射波长峰值为560 nm。对北美萤火虫和日本源氏萤(Luciolacruciate)来源的FLuc,在某些氨基酸位点进行突变,可使其发射波长发生红移[7, 8] 。这种红移成因于激发态氧化型荧光素产物分子刚性的改变,影响了能量的迁移过程。野生型荧光素酶的发光强度及其发射波长随环境pH 波动较大。通过257 位氨基酸突变,可获得新型红移的FLuc 突变体,其发射波长及发光强度可在不同pH 环境中维持稳定[9] 。FLuc发光机制明确,其化学发光的量子产率高达88%,信号强度高且背景噪音低,具有极高的检测灵敏度和极宽的线性检测范围;其编码基因能在细菌、酵母、哺乳动物细胞等多种体系中成功表达;且其突变体各异的发光特征满足了多样的研究需求。FLuc已迅速成为一种在分子生物学领域广泛应用的研究工具。
2. 2　细菌荧光素酶
细菌荧光素酶LuxAB 是由两个亚基组成的异二聚体,催化氧化长链脂肪醛,发射波长在490 nm左右[10] 。在陆生发光细菌如明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)和海洋发光细菌如哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)中[11] ,Lux 基因操纵子除含LuxA(编码分子量为42kD 的α 亚基)和LuxB(编码分子量为37 kD 的β 亚基)外,还包含基因LuxC、LuxD 与LuxE,分别编码参与底物脂肪醛加工的还原酶、转移酶与合成酶[12] 。以Lux 基因为基础,LuxAB 的应用为细菌学研究提供了简便的研究工具。在真核细胞中,Lux 也成功作为报告基因[13] ,提示LuxAB 有更广泛的应用范围。LuxAB 也存在一定的缺陷:由于该蛋白质稳定性差,酶活性受温度影响很大,常温即易失活;在真核细胞中的发光强度较FLuc 低,灵敏度相对较差。通过LuxAB 的α 和β 亚基融合,并进一步改造,可获得单体的细菌荧光素酶,热稳定性明显提高,并极大提高了量子产率[14] 。
2. 3　海肾荧光素酶
RLuc 是一种来自海洋腔肠动物海肾(Renillareniformis)的荧光素酶,为含有311 个氨基酸残基的单体多肽链,分子量36 kD[15] 。它是个被广泛应用的海洋来源荧光素酶,催化腔肠素产生化学发光,发射波长在480 nm 左右。其量子产率较FLuc低(7%),但该反应不需要ATP 及其他辅因子的参与,反应限制条件更少,在基于荧光素酶的生物发光检测技术中同样应用广泛。
RLuc 在细胞及体内的稳定性差,影响检测的灵敏度。RLuc 突变体RLuc-C124A 在鼠血清中的稳定性可提高6 倍[16] ;多个氨基酸位点突变获得的RLuc8,在鼠血清中的稳定性提高200 倍,光亮度提高4 倍[17] ;新型突变体Super RLuc8 的酶分子热稳定性提高,光信号半衰期显著延长,发光波长红移至绿光范围[18] ,更适合应用于在体成像。
2. 4　新型低分子量荧光素酶
近10 余年来,从海洋生物中发现了几种以腔肠素为催化底物的新型荧光素酶,它们通常具有较小的分子量约20 kD。低分子量荧光素酶分子理化性质一般更加稳定,在体内表达更具优势,空间位阻相对较小,理论上对融合蛋白质间的相互作用影响更弱,目前更广受重视,逐渐应用于多项领域。
2. 4. 1　Gaussia Luciferase (GLuc)　GLuc 是从海洋桡足类动物Gaussia princeps 中发现的一种荧光素酶,分子量为19. 9 kD[19] 。其蛋白质序列由185 个氨基酸残基组成,包含N 端17 个氨基酸残基的分泌信号肽,使天然的GLuc 可分泌至细胞外。其序列中有11 个半胱氨酸残基,形成5 对分子内二硫键,具有更稳定的理化性质,对高温、低pH、过氧化氢环境更为耐受。研究表明,二硫键的正确形成是GLuc 具有催化活性的关键[20] ,但多对二硫键的存在也使通过大肠杆菌表达体系获得活性蛋白质分子更为困难。GLuc 以天然腔肠素作为催化底物,发射波长峰值为480 nm。与FLuc 和RLuc 相比,GLuc发光强度更高。
GLuc 的发光信号衰减极为迅速,在一定程度上限制了它的应用。通过亮氨酸替换甲硫氨酸的策略,可使突变型GLuc 的发光信号半衰期延长,而保留GLuc 的发光活性[21] 。采用其他策略获得的几种GLuc 突变体,不仅发光信号半衰期延长,而且发光强度大幅提升,发射光谱红移[22] 。
2. 4. 2　Oplophorus Luciferase ( OLuc) 　OLuc 是从深海虾Oplophorus gracilirostris 中发现的一种荧光素酶,催化腔肠素发光[23] 。天然的OLuc 分子量为106 kD,包括2 个35 kD 的亚基和2 个19 kD 的亚基。研究表明,仅19 kD 的小亚基具有催化活性。19 kD 小亚基自身分子热稳定性差,极易失活。经多位点随机突变进行结构优化,筛选获得一个包含171 个氨基酸残基的荧光素酶突变体,具有良好的分子稳定性,命名为NanoLuc (NLuc)[24] 。NLuc与其母体分子OLuc19 一样,在分子氧存在的条件下与底物作用产生生物发光,发射波长峰值在460nm 处。与FLuc 和RLuc 相比,NLuc 具有更稳定的性质:在8 mol/ L 尿素的变性条件下,或在55℃加热30 min,可维持活性不变;在较宽的pH 范围内均可发挥更大催化效能,并在偏酸的环境下保持一定活性。通过筛选一系列腔肠素类似物,还获得1 个新型合成底物Furimazine[24] ,其理化性质更稳定,自发光水平更低,且对NLuc 的催化有更高的选择性,二者组合可构成更为灵敏的检测体系。NLuc 催化Furimazine 的生物发光反应,信号半衰期长达120min;产生的光信号更强。在细胞裂解液中,NLuc 比等摩尔的FLuc 和RLuc 发光信号强约150 倍。NLuc 融合不同功能片段(NLuc-PEST、secNLuc) 可获得快速降解或分泌特性,更适于进行连续动态监测。目前,NLuc 的应用范围与研究热度远超其母体分子OLuc19。
2. 4. 3　Metridia Luciferase ( MLuc) 　MLuc 是来源于另一种海洋桡足类动物Metridia longa 的荧光素酶。这种单亚基分子分为2 种亚型即MLuc164 和MLuc39,它们的分子量分别为24 kD 和22 kD。二者均以天然腔肠素作底物,发射波长为480 nm 左右[25, 26] 。MLuc 与GLuc 的氨基酸序列同源性较高,二者理化性质及发光特征也较为相似。相比其他荧光素酶,MLuc 不具有明显优势,故在各种生物发光检测技术中应用较少。上述几种荧光素酶基本特征总结如Table 1。

3　基于荧光素酶的作为蛋白质相互作用的检测方法
　　各种荧光素酶,因其催化特征及独特的分子特性,可以作为分析蛋白质相互作用的有效工具,发挥化学发光检测的各项优势,从而方便安全地获得更灵敏的检测结果。3. 1　蛋白质片段互补检测蛋白质片段互补检测( protein-fragment complementation assay, PCA)[27] 中传统的报告蛋白质,如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光蛋白质等,可用荧光素酶替代。FLuc 在合适的位点分割为2 个片段,分别与2 个待测目的蛋白质融合表达,单独的片段丧失其原有活性且无法自身结合。两个目的蛋白质发生相互作用,可使荧光素酶片段结合互补,形成具有完整活性的非共价蛋白质复合体。目的蛋白质的相互作用可由FLuc 的催化活性,即化学发光信号来准确反映。常用的FLuc 互补片段为FLucN (2~416 aa)和FLucC (398~550 aa),其他分裂方式的互补片段, 也可构建适宜的检测体系[28, 29] 。PCA 仅需2 种重组融合蛋白质参与,在极简单的体外反应体系中即可检测蛋白质相互作用。基于FLuc 片段互补检测的体外检测体系,在优化FLuc 片段的稳定性后,可进行高通量筛选[30] 。在哺乳动物细胞[31] 、拟南芥原生质体[29] 、丝状子囊菌[28] ,甚至完整植物叶片[32] 及鼠[31] 等复杂体系中,也可用FLuc 片段互补观察蛋白质相互作用。FLuc 极高的量子产率、良好的安全性以及生物发光较强的组织穿透能力,使该互补体系可在小动物水平实现连续动态观察。
RLuc 的催化反应不需ATP 及其他辅因子,使其片段互补检测具有独特优势。在一些特殊的细胞器如高尔基体中,由于缺少ATP,只能采用RLuc 代替FLuc 观察蛋白质相互作用[33] 。RLuc 也可有不同的分割方式,如分割为1~229 aa 和230~311 aa,或1~110 aa 和111~311 aa 片段。利用RLuc 片段互补在哺乳动物细胞中可检测多种蛋白质相互作用,如病毒蛋白质间及其与宿主蛋白质间的相互作用[34, 35] ;还在霍乱弧菌中,验证了趋化相关应答调节因子CheY3 与其磷酸酶CheZ 间的相互作用[36] 。RLuc 互补片段的分子量显著低于FLuc 的互补片段,也是RLuc 应用于PCA 的一个优势。
GLuc 和NLuc 具有更低的分子量,其片段融合进一步减少了对目的蛋白质结合的空间位阻影响,更有利于观察蛋白质相互作用,降低检测的假阴性率。将GLuc 的C 端片段与趋化因子CXCL12 融合,N 端片段分别与其两种受体融合,可在活细胞和小动物水平观察趋化因子与其受体的结合,并用于筛选靶向相关受体的小分子抑制剂[37] 。利用GLuc 片段互补检测体系的高灵敏度,可检测细胞内低表达水平蛋白质间的相互作用,如研究蛋白质激酶B(protein kinase B, PKB)与转录激活因子Smad3 的结合,及胰岛素和转化生长因子-β ( transforminggrowth factor-β, TGF-β)对该结合的影响[38] 。应用GLuc 片段互补体系,还发现了细胞凋亡、自噬等相关信号通路中一些未知的蛋白质相互作用,促进了对细胞死亡网络的理论构建[39] 。
Dixon 等[40] 利用NLuc 建立了独特的NanoBiT(NanoLuc Binary Technology)片段互补体系。N 端18 kD 大片段与C 端1. 3 kD 小片段构成两个互补片段;这个小片段不仅可与目的蛋白质融合表达,还可通过化学缀合方式方便地连接小分子多肽及结构复杂的蛋白质大分子,应用范围进一步扩大。Zhao等[41] 设计了另一种特别的互补体系:1~65 aa (N)和66~171 aa (C)片段可自然组装成全酶,将N 端片段与Aβ 蛋白或其他目的蛋白质融合,当目的蛋白质聚集时,加入的C 端片段不能与融合蛋白质互补,从而无法结合获得全酶活性,由此评估蛋白质聚集倾向。基于该方法可建立高通量筛选蛋白质聚集抑制剂的平台。

3. 2　基于FLuc 突变体的功能互补方法
依据与PCA 类似的原理, Ohmuro-Matsuyama等[42] 将位于FLuc 不同结构域的腺苷化与氧化活性中心[3] 分别突变,获得了2 种FLuc 突变体。它们仅具有腺苷化功能或氧化功能,无法独立催化底物产生化学发光。而与其融合的2 种目的蛋白质发生相互作用时,二者发生功能互补,共同催化发光。这种特别的基于FLuc 蛋白质相互作用检测( firefly luciferase-based protein-protein interaction assay,FlimPIA) 技术, 在FK506 结合蛋白12 ( FK506 binding protein 12, FKBP12)与FKBP-雷帕霉素结合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB)相互作用模型中获得了验证。与FLuc 片段互补检测方法相比,FlimPIA 弥补了荧光素酶片段稳定性差缺陷,增强检测信噪比[43] ,但可能存在融合探针分子量较大所带来的空间位阻问题。
3. 3　共振能量转移技术
共振能量转移技术中,能量供体与受体一般为荧光发色团,构成荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)[44] 。供体和受体分别与2 个目的蛋白质连接,可进行目的蛋白质间相互作用的研究。将荧光素酶代替荧光蛋白质作为能量供体, 即生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)技术[45] ,解决了传统FRET 技术由于激发光导致的光毒性、光漂白等问题,降低样品背景噪音,检测灵敏度更高。
RLuc 与荧光蛋白质是BRET 检测体系中常用的供体和受体。融合了目的蛋白质的供体和受体在细胞内共表达,可以在细胞水平展开研究,如检测信号转导通路中有关蛋白质的相互作用[46, 47] 。RLuc在应用时量子产率低,发光信号较弱,而采用突变体RLuc8,可获得增强的检测信号。RLuc8 与绿色荧光蛋白质配对,检测了蛋白质激酶CK2 的聚集[48] ,以及G 蛋白偶联受体与β-抑制蛋白间的结合[49] 。FLuc 催化的发光波长范围与常用的荧光蛋白质发射光谱重叠,使其在BRET 系统中应用较为局限。为了利用FLuc 的高量子产率,有报道[50] 尝试,将FLuc 与红色荧光蛋白质配对,成功检测了抗谷胱甘肽转移酶抗体介导的谷胱甘肽转移酶与G 蛋白间的相互作用。
Cui 等[51] 将单体LuxAB 及增强型黄色荧光蛋白质,分别与待测的两个目的蛋白质融合,用于在原核体系中动态检测蛋白质间相互作用。该检测体系在几种典型的蛋白质相互作用模型中获得了验证,并观察到渗透压和pH 值的改变对细菌调节蛋白OmpR 多聚化的影响,证实该体系监测动态蛋白质相互作用的可行性。
近几年来,低分子量荧光素酶GLuc 和NLuc 在BRET 中的应用日趋普遍。NLuc 作为能量供体,可提供更稳定的检测信号。利用NLuc 融合G 蛋白偶联受体,能检测其与各种荧光配体间的结合[52] 。将NLuc 与红色荧光基团配对,在几个蛋白质相互作用模型中验证了该体系具有更广泛的动力学检测范围[53] 。

3. 4　酵母双杂交检测
酵母双杂交实验是在活细胞体系中检测蛋白质相互作用的一种常用分子生物学方法[54] 。将转录激活子的DNA 结合域和转录激活域分别与两个待测目的蛋白质进行融合表达,两种产物无法单独激活转录;当两个目的蛋白质发生相互作用而靠近时,DNA 结合域和转录激活域形成的复合体可激活下游报告基因的转录。通过对报告基因转录水平的检测,可判断目的蛋白质间是否存在相互作用。由于荧光素酶生物发光信号背景噪音更低,灵敏度更高,因此荧光素酶报告基因已取代编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光蛋白质等的传统报告基因,成为主流的研究工具。FLuc 在细胞内的半衰期相对较短,可动态反映细胞中蛋白质相互作用情况,在荧光素酶报告基因中最为常用。此外,因GLuc、NLuc 等低分子量荧光素酶的独特优势,依据这些荧光素酶构建的报告基因体系受到越来越多的重视,目前已有商品化报告基因载体面市。
3. 5　基于荧光素酶示踪的蛋白质相互作用研究方法
一些研究蛋白质相互作用的生化方法,有赖于亲和基质吸附对蛋白质复合体的分离作用,如免疫共沉淀、下拉实验等。这些方法中,有时需要对参与相互作用的某个蛋白质进行标记示踪,从而观察其相互作用。
实际上,多肽抗原与其抗体的相互作用,也可视为蛋白质相互作用的一种。在研究抗原抗体结合的免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)技术中,同位素标记是经典的示踪手段。利用荧光素酶对目的蛋白质进行示踪,可取同位素,获得非放射性标记探针。将荧光素酶与抗原融合表达制备探针,利用亲和基质分离其与抗体形成的复合物。通过测定样品中荧光素酶的活性,可分析抗原抗体间的相互作用。以RLuc 标记人呼吸道合胞病毒核蛋白,使用IP 技术检测新生儿血清中呼吸道合胞病毒抗体,可作为诊断该病毒感染的灵敏指标[55] 。利用GLuc 标记锌转运蛋白,同样可测定血清中抗锌转运蛋白抗体的含量,从而筛选1 型糖尿病高危人群[56] 。将NLuc与胰岛素原融合,可用IP 技术成功检测到1 型糖尿病患者血清中胰岛素自身抗体,有望应用于临床1型糖尿病的诊断工作[57] 。此外,将M 型磷脂酶A2受体(PLA2R)片段与NLuc 融合,通过IP 方法检测自发抗体水平,可以确定疾病发展阶段,区分原发性与继发性膜性肾病,检测疾病活动度及监测临床疗效[58] 。
类似地,利用FLuc 和RLuc 分别标记2 个待测目的蛋白质,将FLuc 定向结合于固相,通过测定RLuc/ FLuc 发光信号比例,成功检测了Jun/ Fos 异二聚体形成、干扰素调节因子3 二聚化等多种蛋白质间相互作用[59] 。多肽配体与受体的结合是另一种典型的蛋白质相互作用。传统的配体受体结合实验采用同位素作为示踪标记。低分子量荧光素酶NLuc 标记配体作为探针,与表达于细胞表面的膜受体进行结合测定,可获得相应的受体配体结合的有效参数[60, 61] 。该方法的灵敏度可达到同位素方法水平,且操作更加简便。
4　问题与展望
荧光素酶催化的生物发光及其检测独具特点和优势。将几种荧光素酶应用于蛋白质片段互补检测、共振能量转移、酵母双杂交实验、免疫沉淀等技术手段,弥补了传统方法的不足,使蛋白质相互作用的研究过程更加方便快捷,有利于构建以蛋白质相互作用为靶向的多种药物筛选模型,提供的药物筛选平台。
生物发光检测也具有一定的局限性。首先,荧光素酶分子量相对较大,可能对融合目的分子产生一定的空间位阻,从而影响它们的相互作用,导致假阴性结果的产生。其次,荧光素酶作为一种蛋白质分子,酶活性易受反应体系组份、pH、温度等多种因素的影响,表现为发光强度及波长范围等的异常,干扰检测数据的分析。同时,大部分荧光素酶的通用底物coelenterazine 稳定性较差,自氧化发光,产生一定的背景信号。此外,与传统同位素标记、荧光分子标记、基于荧光蛋白质的片段互补等技术一样,这些生物发光检测方法,也无法直接区分由2 种蛋白质分子间的非特异性结合所产生的假阳性信号,需要更多实验进一步鉴别。
回顾几十年来的研究进展,荧光素酶正朝着稳定、低分子量、高发光强度的方向发展,底物分子结构也不断优化,生物发光检测技术应用范围逐步拓宽。相信在今后的研究中,新型荧光素酶及其选择性底物的涌现,可进一步完善现有生物发光检测体系,使生物发光在更多研究领域获得广泛的应用。

文献作者：宋晓菡,　王楠，中国医学科学院& 北京协和医学院药物研究所新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室,