病毒介导的基因转移

病毒介导的基因转移
对于难以采用脂质体介导进行转染的细胞类型，则通常使用病毒载体。病毒介导的转染又称为转导，它为难以转染的细胞类型提供了一种方法，可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法(Glover et al , 2005; Pfeifer and Verma, 2001)。病毒转导的主要优点之一在于，该过程可以在活体内(体内)或培养细胞中(体外)进行，基因输送效率达95–99%。

病毒载体的主要特点
病毒载体可根据其特定的应用量身定制，但必须遵循下列主要特性。
• 安全性：病毒载体有时来源于病原性病毒，应对其进行适当的修饰，使病毒操作的风险最小化。通常需要敲除对病毒复制至关重要的部分病毒基因组，使病毒感染细胞并导入病毒载体，但应防止在无辅助病毒存在的情况下生成新的病毒粒子，提供缺失的关键蛋白质。但目前病毒载体使用的安全问题是插入突变，病毒DNA染色体异位整合会破坏肿瘤抑制基因的表达或激活原癌基因，从而引起细胞的恶性转化(Glover etal , 2005)。
• 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造成影响。这对于需要体内基因导入的研究尤其重要，因为如果载体被视为外来入侵者，则生物体将发挥免疫应答作用(Nayak and Herzog, 2009)。
• 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产生不利影响。因此，通常避免使用不稳定的载体。
• 细胞类型特异性：大部分病毒载体都可以感染很多细胞类型。但有时反之更好。可以修饰病毒受体，使病毒靶向特定种类的细胞。该病毒修饰方法称为假型化。
• 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。

常用病毒载体
腺病毒是具有广泛细胞嗜性的DNA病毒，可以瞬时转导几乎所有哺乳动物细胞类型。腺病毒通过结合Coxsackie/腺病毒受体(CAR)进入靶细胞内(Bergelson et al ,1997)。腺
病毒与CAR结合后，通过整合素介导的内吞作用被内化，然后主动运输至细胞核内，其DNA可在细胞核内游离表达(Hirata and Russell, 2000)。尽管腺病毒载体适用于多种
细胞类型的瞬时转染，但对于一些难以转染的细胞系(如非分裂细胞)及稳定表达应用，则慢病毒。腺病毒的包装容量为7–8 kb。
逆转录病毒是一种正链RNA病毒，可以将基因组稳定整合至宿主细胞染色体内。当病毒包被上具有广泛嗜性的包膜，如水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)，形成假型病毒，则这些病毒可以进入几乎所有哺乳动物细胞。但是，大部分逆转录病毒依靠细胞分裂过程中核膜的破裂感染细胞，因此需要细胞复制方可完成转导。逆转录病毒的其他缺点包括可能引起插入突变并激活潜伏性疾病。与腺病毒类似，逆转录病毒可以携带约8kb的外源性基因。

慢病毒是逆转录病毒家族的一个亚群；因此，它们可以整合至宿主细胞基因组中，实现稳定、长期的表达(Anson, 2004)。与其他逆转录病毒不同，慢病毒采用活化的细胞核输送途径转导非分裂、终末分化的细胞群体(如神经细胞和造血细胞)，是一种用途更广泛的工具。
腺相关病毒能够转导各种分裂和非分裂细胞，但需要同时感染一种辅助病毒(如腺病毒)或疱疹病毒，在包装细胞内形成重组病毒粒子。这会导致难以获得不含辅助病毒的高质量病毒储液。此外，腺相关病毒的更大包装容量仅为4 9 kb。另一方面，腺相关病毒在大多数细胞类型中具有低免疫原性，且能够整合至人染色体的特定区域内，从而避免了插入突变。
适用于蛋白质过表达的其他病毒载体系统包括杆状病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒载体。杆状病毒一般感染昆虫细胞，重组杆状病毒可以作为基因转移载体，在各种哺乳动物细胞中用于重组蛋白的瞬时表达。此外，杆状病毒载体中还包含显性选择标记物，从而可以提取出稳定表达重组基因的细胞系(Condreay et al , 1999)。利用牛痘病毒载体可以将较大的DNA片段导入各种哺乳动物细胞中。但是，感染牛痘病毒的细胞会在一或两天内死亡，因此该系统仅限用于瞬时蛋白生产。单纯疱疹病毒是一类可用于神经元感染的双链DNA病毒。

常用的报告基因
可诱导可鉴别特性的常用报告基因通常包含荧光和化学发光蛋白。
表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞可在LUYOR-3410紫外光照射下发出绿色荧光。需要采用专门的显微镜观察单个细胞。此外还有黄色和红色荧光蛋白可供选择，一次可以检测多个基因。它常用于检测基因表达。
荧光素酶用作实验试剂时通常是指北美萤火虫荧光素酶，尽管还有来源于其他种属的萤火虫的重组荧光素酶产品可供选择。荧光素酶可以催化其底物(一般为荧光素)，根据荧光素酶基因的不同，产生黄绿色或蓝色荧光。由于荧光素酶的生物发光无需激发光，因此几乎不会出现自发荧光，可以实现无本底荧光。
GUS分析(使用β-葡萄糖苷酸酶)是一种的单细胞检测方法，无需复杂设备可将细胞染成蓝色。其缺点是细胞会在此过程中死亡。它常用于植物科学。
蓝-白斑菌落筛选可用于细菌和真核细胞。细菌lacZ基因编码β-半乳糖苷酶。加入含有特定半乳糖苷(如X-gal)的培养基后，表达基因的细胞将X-gal转变为蓝色，通过裸眼即可观察。

常用RNAi术语表
RNAi：核糖核酸干扰 (A Fire and C Mello et al , 1998中使用)。
siRNA：短片段干扰RNA。siRNA是21–25 bp带有二核苷酸3’突出端的dsRNA，在RNA干扰通路中，在Dicer的作用下由较长的dsRNA加工而来。导入合成siRNA可以诱导哺乳动物细胞的RNAi。siRNA还可来源于内源性前体。
shRNA“”短发夹RNA；又称为短干扰发夹。可以采用基于载体的shRNA将siRNA导入细胞，实现稳定的基因沉默。采用Pol III型强启动子控制靶序列的转录，形成长度可变的发夹和茎环结构，然后通过细胞siRNA机制进行处理。shRNA一旦进入细胞，可以通过RNAi下调具有互补序列的基因的表达。
miR RNAi：表达microRNA的载体，用于RNAi。miRNA是19–23 nt的单链RNA，来源于单链前体转录本，它含有碱基配对不的发夹结构。miRNA在沉默复合物中的功能与RISC类似。
化学修饰的siRNA：具有化学修饰的siRNA分子。
RISC：RNA诱导沉默复合物(RISC)。由蛋白质和siRNA组成的核酸酶复合物，可以靶向并剪切与RISC复合物中siRNA互补的内源性mRNA。
脱靶效应：导入siRNA或d-siRNA库后，一个或多个非靶向基因出现基因功能丧失的现象。该效应可能由siRNA的正义链介导，它可以启动不相关基因出现功能丧失。脱靶效应也可以是特定siRNA的反义链引起的二级效应，它与非靶向基因具有足够的同源性，抑制了该基因的表达。