重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体

蛋白表达载体系统
重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv类。B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry
分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能更好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。
这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。
2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。
4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。
5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程．用mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。
荧光素酶
来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。
优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速，容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统，因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。
基于荧光素酶的特性，我司研发提供的Secrete-Pair™ Dual Luminescence Assay Kit可用于分析双报告系统中Gaussia荧光素酶（GLuc）和分泌型碱性磷酸酶
(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均为分泌型报告蛋白，无需裂解细胞即可便捷地从细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。

SNAP-Tag
SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，更大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。
SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。
检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。
将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag ®
HaloTag™标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag™配基有效地共价结合，是多功能标签的一种。这个分子量为33KDa的单
体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。HaloTag™配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag™蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：(1)一个通用的HaloTag™反应联结子，结合HaloTag™蛋白；(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag™蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

Avi Tag
AviTag ™标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，是多功能标签的一种。与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，作为纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。
Avi Tag标签系统具有以下几大优点:
1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；
2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；
3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

His6：
His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，
可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化，是促溶解度标签的一种。
使用His-tag有下面优点：
1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；
2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；
3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；
4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；
5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag:
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），是一种促溶解度标签，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。
2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。
3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blotting、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

MBP:
MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。作为促溶解度标签家族中一员，MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。
纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST:
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD，是一种促溶解度标签。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标
签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。
纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。
如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

SUMO
SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），作为促溶解度标签的一种，SUMO是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。
此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

HA
HA标签蛋白，一种抗体免疫共沉淀标签，序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc
C-Myc标签蛋白，是抗体免疫共沉淀标签的一种，由11个氨基酸组成，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。