荧光蛋白载体构建和基因转入

荧光蛋白的功能非常多，在从微生物学到系统生理学的整个生命科学领域中得到了成功的应用。这些独有的探针在培养的细胞核组织和活体动物中作为基因表达的报告基因得到了非常多的应用。在活细胞中，荧光蛋白是追踪蛋白质、组织和其他细胞成分定位和动态变化最常用的工具。已经有很多技术被开发出来用于构建荧光蛋白融合产物和提高他们在哺乳动物和其他系统中的表达。最主要的引入荧光蛋白方法就是将荧光蛋白的基因序列构建到细菌质粒和病毒载体中，然后转入细胞体内。

荧光蛋白融合表达产物可以通过适当的载体瞬时或者稳定的转入到哺乳动物和其他细胞中。在瞬时转染中，基因转染实验（通常指的是瞬时转染），质粒或者病毒的DNA并不需要跟寄主组织的染色体整合，但是需要在一个短时期内在细胞质中表达。基因融合产物的表达情况可以很容易的通过检测荧光发射情况观察，一般在质粒DNA转染到哺乳动物细胞后72-96h后即可观察。在很多情况中，质粒DNA可以和基因组稳定的整合到一起。瞬时或者稳定转染主要依赖于所研究的目标生物的种类。

在荧光蛋白基因转移实验中的基本的质粒载体结构中有几个是必须具备的。质粒中必须含有编码细菌DNA复制起始原点的核苷酸序列和抗性基因。这些组成部分通常叫做穿梭序列，可以使质粒在细菌寄主中选择和繁殖，以产生用于哺乳动物转染的多种载体。除此之外，质粒还必须含有一个或多个真核的基因序列来控制mRNA转录起始，哺乳动物的多聚腺苷酸化信号，一个内含子（可选），和一个在哺乳动物细胞中共选择的基因。转录元件在哺乳动物寄主表达感兴趣的基因融合产物是必要的，选择性基因通常是抗生素抗性基因，是含有质粒的细胞可以再抗生素存在条件下生长。这些组成部分会根据质粒设计的不同而改变，很多载体有很多别的组成部分可以适用于特殊的用途。

图7所展示的是一个商用的改造过的包括酶切位点和基因分布细菌质粒的图谱。这个质粒中包含有增强型黄色荧光蛋白的编码序列，它同内质网钙结合蛋白融合到一起（一个常驻蛋白）。这个基因在易感哺乳动物细胞中的表达产物和含有EYFP的嵌合肽定位在内质网膜上，专门用于这个组织的荧光标记。主载体是一个pUC的多拷贝（大约500）质粒改造的来的，它包含细菌的复制起点，可以在特定E. coli菌株的复制。卡那抗性基因可以在细菌中表达可以作为筛选标记。

这个EYFP载体还包括人类巨细胞病毒的启动子（CMV）用于基因在人类和哺乳动物细胞中启动基因的表达，和一个f1噬菌体单链DNA产物的复制起点。载体的骨架还包括一个猴病毒（SV40）的复制起点，它在表达SV40的T抗原时有活性。抗生素G418用于筛选未定的转化子，它可以被新霉素抗性表达框（包括SV40的早期启动子，新霉素抗性基因和HSV-TK的多聚腺苷酸化信号）激活。6个单一的限制性酶切位点在图中标示出，可以使载体的用途更为广泛。

荧光蛋白表达载体的繁殖，分离和转染

成功的哺乳动物细胞转染实验依赖于高质量的细菌内毒素相对少的质粒或病毒DNA载体。在原始状态下，环形质粒DNA分子三级超螺旋结构。多年来，超螺旋质粒和病毒DNA的纯化主要是通过氯化铯密度梯度离心实现的。这个技术的设备和材料都很贵，根据浮力密度来将质粒（超螺旋）DNA从线性染色体和缺口的环状DNA中分离出来。近来，简化的离子交换柱吸附的方法（mini-prep）可以快速的提取出高质量的质粒DNA。

特殊的细菌突变体，叫做感受态细胞，它已经用于质粒载体的扩增和繁殖中。此种细菌有很多突变体用于质粒的复制，通过化学渗透法将DNA通过细胞膜和细胞壁转入到细胞内，这一过程叫做转化。转化后，细菌在含有抗生素的培养条件下生长到对数生长期。细菌培养物离心收集，用含有RNA酶的碱裂解液裂解。裂解后加入中和液中和离心，再将上清液过离子交换柱，其他杂质如RNA，DNA和蛋白都被洗掉，溶解在高盐溶液中，然后用乙醇或异丙醇沉淀溶解的质粒DNA，离心，洗涤，再溶解。纯化好的DNA就用于转染实验中。

哺乳动物细胞的转染必须在非常好的生理条件和对数生长期完成，很多已经商业化生产转染用试剂可以优化培养细胞吸收质粒DNA的条件。这些技术包括从简单的磷酸钙沉淀法到脂质体法（将质粒DNA包装在与细胞膜融合的脂质体中再转入到细胞质中）。脂质体转染技术已经在很多转染实验中得到了广泛的应用，是目前大部分转染实验所采用的方法。

虽然瞬时转染通常导致在相对短的时期内质粒基因产物丢失（若干天），但是稳定转染细胞系要在很长时间才能获得（几个月到数年）。稳定的细胞系可以通过质粒骨架上含有的抗性基因进行筛选。哺乳动物细胞系中最常用的筛选抗生素是蛋白合成抑制药物G418，但是在每一个细胞系中的用量是不同的。另一个常用的抗生素，包括潮霉素和嘌呤霉素，已经用于稳定细胞的选择。获得稳定细胞系的最有效的方法是起始转染是采用的方法。在这点上，电穿孔法已经被证实是用线性质粒获得稳定转染细胞。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电穿孔法需要特殊的仪器设备，但是，当大量转染时，这个耗费跟脂质体转染所用试剂的消耗是差不多的。