洋葱表皮细胞瞬时转化

洋葱表皮细胞瞬时转化

实验材料准备
选取新鲜、生长状况良好的洋葱，在超净工作台上除去外面的1-2层鳞片，用无菌解剖刀十字形切开洋葱球茎，取球茎内部较新鲜肥厚的鳞片（第4-7层最为理想），在内表皮（凹面）用刀片划出面积约2cm × 2cm的小方块，用无菌镊子将小方块撕下，贴近叶肉的一面朝下，平铺于含有MS培养基的培养皿内，28℃弱光下预培养4 h，然后利用基因枪法进行目的基因的转化。

金粉准备
(1) 称取60 mg金粉放入1.5 mL离心管，加入1 mL无水乙醇，涡旋振荡2 min；
(2) 冰上放置5 min后，10,000 r/min离心1 min，去上清；
(3) 按步骤1，2重复清洗金粉2次；
(4) 加入1 mL无菌水，涡旋振荡2 min，冰上放置5 min后，10,000 r/min离心1 min，去上清；
(5) 重复步骤4两次；
(6) 加入1 mL无菌水，在涡旋振荡条件下，按50 μL每份分装到1.5 mL离心管备用。

质粒DNA包埋金粉
(1) 取50 μL已分装好的金粉悬浮液，在涡旋振荡条件下依次加入5 μL质粒DNA（1 μg/μL），50 μL 2.5 mol/L CaCl2，20 μL 0.1 mol/L亚精胺；
(2) 涡旋振荡3 min，室温下，10,000 r/min离心10 sec，尽可能弃去上清；
(3) 加入50 μL无水乙醇，可进行4次基因枪轰击。

基因枪轰击操作
射击参数：轰击微粒运行距离9 cm，压力1350 psi，真空度20 mmHg。将轰击结束后的材料，继续在28℃弱光下培养8 h，然后使用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源照射，佩戴LUV-30A观察眼镜观察EGFP基因的表达或使用激光共聚焦显微镜在488 nm波长激发下观察EGFP基因的表达。