质粒的纯化和问题解答

质粒
质粒是染色体外的小环状脱氧核糖核酸（DNA），其独立于染色体DNA复制。尽管发芽酵母和裂变酵母可以保留质粒，但质粒的宿主几乎是细菌。这种小的环状DNA被广泛用作分子生物学，生物化学，生物技术，细胞生物学等领域的DNA载体。这意味着质粒纯化/分离是这些研究领域中非常基础的实验，并且该实验几乎每天都在几乎每个实验室中进行。质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子，多存在于细菌及酵母菌等生物中，是基因工程中最常用的运载体，担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。基因表达载体的构建（也就是目的基因与运载体结合）是基因工程的核心步骤，用作运载体的质粒更是掌上明珠。我们需要从细菌中分离出质粒以备后用。

摇菌培养
即培养细菌使质粒扩增
1.将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板（一种培养基，使质粒扩增）。
2.置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3.灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。

收获细菌并裂解
1.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。
7.室温，1500rpm，高速离心15min。
8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。
9、弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。
10、重复上一操作。
11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。
12、样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

质粒的纯化
1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。
2. 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3. 4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.
4. 弃去上清，70%乙醇洗2次。
5. 空气干燥，可置超净工作台干燥。
6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。
7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

质粒纯化故障排除
质粒DNA纯化（众所周知的质粒制备）是实验室中最常用的方法之一。准备包括；细菌培养物的生长，细菌细胞的收获和裂解以及质粒DNA的纯化。纯化的质粒DNA进一步用于下游过程，例如：克隆，基因转移，转化或测序。可以改进几个步骤以获得更高的产量或消除最终产品中的污染。
如果您遇到问题，请不要担心！故障排除指南可为您提供帮助。

细胞裂解不完全
细胞密度过高：减少培养体积。
细胞沉淀未完全重悬：在细胞裂解前，使用适当的缓冲液或溶液适当重悬细胞沉淀。
碱裂解步骤不足：检查裂解溶液中是否有盐沉淀。

DNA或RNA污染
基因组DNA污染：在裂解和中和步骤中，请勿过度剧烈涡旋细胞。
冻干的RNase不能完全溶解：按照方案中的说明溶解RNase。
RNA污染：使用前，将RNase加入重悬溶液中。
细菌细胞过多：减少培养量，以免反应或色谱柱超负荷。
文化太老了：不要使用培养时间超过24小时或已经处于死亡阶段的文化。

产量低或没有
培养体积太高：减少培养体积以增加裂解细胞的数量。
质粒不繁殖：使用新鲜条纹细菌细胞进行接种。
选择性压力太低：在培养过程中使用适量的抗生素，以避免没有目的质粒的未转化细胞过度生长。
未立即处理培养物：始终使用新鲜种植的培养物。如果您需要另的准备工作，沉淀细胞，除去培养基，然后将细胞沉淀保存在-70°C。
套件组件的有效性降低：将套件组件存储在适当的条件下。
洗涤液浓度过高：盖紧瓶盖，避免乙醇蒸发。

下游流程性能不佳
其他质粒形式包括：避免质粒DNA变性-不要延长细胞裂解时间，不要超过实验方案的建议。
质粒DNA浓度太低：沉淀质粒DNA并以较小体积重悬以浓缩DNA。
重悬的质粒DNA中存在乙醇：增加干燥时间。

质粒纯化技巧
在质粒制备过程中，请确保使用诸如乙酸钠之类的盐以帮助核酸从溶液中沉淀出来。
带正电荷的钠离子与质粒的糖-磷酸主链反应，使质粒更疏水，在水中的溶解度更低。
乙酸钠在DNA质粒纯化中特别有效
使用氯化锂作为盐纯化RNA质粒
在质粒制备过程中，如果样品很小，体积足够或需要更长的存储时间，请确保使用乙醇作为溶剂。

核酸和盐都比乙醇难溶于异丙醇。
如果您只能将1体积的酒精放入1体积的DNA样品中，请改用异丙醇
在质粒制备过程中，确保将DNA，乙酸钠和乙醇混合物在至少-4°C的温度下孵育大约20分钟。但是，优选-20℃或-40℃。
如果产量低，请尝试将孵育时间延长至30-60分钟
其他技巧
质粒制备中不要使用过多的生物量。