化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法

化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法
一、范围
本方法规定了化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验的范围、规范性引用文件、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。
本方法推荐适用于评价化妆品用化学原料的潜在光毒性。
二、规范性引用文件
下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的条款。注明日期的引用文件，其后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本方法，但是，鼓励使用单位对修订部分的引用进行研究，并提出意见。研究是否可使用这些文件的最新版本。未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本方法。
经济合作与发展组织（OECD）guidelines for the testing of chemicals: 3T3 NRU phototoxicity test. NO. 432

三、术语和定义
下列术语和定义适用于本方法。
（一）光毒性（Phototoxicity）
皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于长波紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应。
（二）细胞活性（cell viability）
测量某一细胞群总活性的参数（如细胞溶酶体摄取活性染料中性红），其数值取决于测定的终点和试验所用的设计方案，并与细胞总数和/或细胞活力相关。
（三）相对细胞活性（relative cell viability）
通过与溶剂（阴性）对照组的相关性来表达的细胞活性，对照组除了未经受试化学物质处理外，整个试验过程与试验组一样（或+Irr或-Irr）。
（四）光刺激因子（photo irritation factor; PIF）
受试物分别在无光照(-Irr)和有光照(+Irr，无细胞毒性的紫外光/可见光（UV/vis）照射)条件下获得两组平行有效的细胞毒性浓度(IC50)，通过比较IC50的值得到的因子。
（五）半数抑制浓度（IC50）
使细胞活性下降50%的受试化学物质的浓度。
（六）平均光效应（mean photo effect; MPE）
受试物分别在无光照(-Irr)和有光照(+Irr，无细胞毒性的UV/vis照射)条件下获得两组浓度反应曲线，通过数学分析导出的数值。
（七）预测模型（prediction model）
将毒性试验结果转换为预测毒性潜力的算法。在本方法中，PIF和MPE可用于把体外3T3中性红摄取光毒性试验的结果转换为对光毒性潜力的预测。

四、试验原理
光毒性是指应用于机体的物质经暴露于光线后诱发或增强（在低剂量水平时明显）的毒性反应，或全身应用一种物质后由皮肤光照引起的反应。中性红是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散的方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。某些化学物质和外界条件作用可引起细胞表面或溶酶体膜敏感性的改变导致溶酶体脆性增高等不可逆的细胞毒性变化，从而导致细胞吸收中性红的能力下降。
本试验方法通过测定3T3成纤维细胞经化学物质和紫外线照射联合作用后细胞吸收中性红的能力或细胞毒性的变化来判断该化学物质是否具有光毒性。

五 试验材料与试剂
（一）光源类型
选择合适的光源必须符合的标准包括：光源发射的光波长能被受试物吸收（吸收光谱），光的剂量（在一个合理的暴露时间内能达到的剂量）能满足已知光毒性化学物质的检测。此外所有的波长和剂量不能有损于试验系统，如（红外区域）热量散发或类似UVB波长的高细胞毒性的干扰，因此光源要求能够稳定地释放UVA和可见光波长。
由于所有的太阳光模拟器都发射出相当数量的UVB，应经过适当的过滤使UVB＜0.1J/cm2。透过96孔组织培养板盖的光强度建议为1.7mW/cm2光强度（即5J/cm2）剂量。
（二）细胞株
选用永生化小鼠成纤维细胞系—Balb/c 3T3成纤维细胞。要求细胞来源必须是具有公信力的机构且能确保细胞品质稳定。
由于细胞对UVA的敏感性随传代数的增加可能增高，建议用于试验的Balb/c 3T3成纤维细胞传代次数更好少于100次。
测试单位若自行培养细胞株，则须定期检测细胞株对UV光的敏感性，并确保无支原体污染。
（三）培养基
采用DMEM培养基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和链霉素，浓度分别为100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2条件下培养。
（四）溶剂的选择
在测定前，应首先评价受试物的溶解度，以选择更佳溶剂体系。溶剂必须不与受试物发生化学反应，不影响细胞活性。
能溶于水且浓度达1000μg/mL的受试物可溶于预先加温（37℃）和灭菌的磷酸盐缓冲液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受试物（＜1000μg/mL）可用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶剂溶解。使用DMSO或ETOH作为溶剂时，其终浓度不得超过总体积的1%（v/v），阴性对照组和受试物组溶剂的体积比例应相同。
（五）受试物的配制
受试物必须在使用前新鲜配制。建议所有的化学物质操作和细胞处理初期都应避免受试物在光激活或光降解的光线条件下进行。
每次实验应设空白对照、溶剂对照和阳性对照（推荐使用氯丙嗪）。加样示意图见附录B。
（六）受试物剂量的设置
需通过预实验确定有光照和无光照条件下受试物的浓度范围。用溶剂将受试物原液使用同一常数稀释因子（如 ＝3.16）稀释成8个浓度，相关浓度范围应包括从更大细胞毒性至几乎无细胞毒性浓度（细胞存活率在20%—的范围）。
如果预实验结果表明在浓度等于1000μg/mL时仍未出现细胞毒性，则建议更高浓度为1000μg/mL；若出现细胞毒性的浓度低于1000μg/mL时，有细胞毒性的浓度少于三种，则需要进行重复试验或使用更小的稀释因子，直至出现有细胞毒性的浓度至少三种。如果根据受试物的溶解度，更高浓度不能达到1000μg/mL，则以更大溶解度时的浓度作为更高浓度，避免受试物在任何浓度出现沉淀。
如果在无光照条件下(-Irr)受试物在更高浓度时仍然不具有细胞毒性，而在有光照条件下(+Irr)出现强烈细胞毒性，则在-Irr试验和+Irr试验中可采用不同的试验浓度。
（七）中性红（Neutral Red，NR）
化学名为3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪盐酸盐(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS编号:553-24-2；或药品标准物质，编号：100460。
（八）中性红溶液
1．中性红原液。称取0.4g中性红染料，溶于100mL蒸馏水（室温条件下可保存2个月）
2．中性红使用液。在79mL DMEM培养液中加入1mL中性红原液，即为使用液。中性红终浓度为50μg/mL。
（九）中性红解吸附溶液
将蒸馏水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（现用现配，储存不超过1小时）。

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