中国热带研究院利用LUYOR-3415研究病原体侵染机理

近期，中国热带科学研究院南亚热带作物研究所在《热带作物学报》发表文献《pBBR1MCS2-Tac-EGFP广宿主载体适宜标记Ralstonia solanacearum》。利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖，是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 导入青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000 菌株中，获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转化子。转接试验结果表明，转化子的抗生素抗性和绿色荧光强度有良好的遗传稳定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP 不影响 GMI1000 菌株的致病力，且 EGFP 蛋白能够在植物中稳定表达。灌根法接种试验结果表明，病原菌在第 1 天即完成对根系的侵染，并在第 6 天扩散至其他组织，随后造成植株萎蔫。研究结果表明所获转化子可用于后续的病原菌侵染机理等方面的研究。

1.2 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 电击转化及检测

利用电转化方法将pBBR1MCS2-Tac-EGFP转化R. solanacearum GMI1000 菌株。GMI1000感受态的制备和电转化方法参考张治飞[13]的方法。电击转化后取100 μL 的菌液涂布于含有50 mg/L 卡拉霉素的NA 固体培养基上（葡萄糖5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏3 g/L，琼脂粉7 g/L），30 ℃培养48 h。利用LUYOR-3415RG 双波长荧光蛋白激发光源在440 nm 激发光下检测转化子EGFP 的表达。根据EGFP 更大开放阅读框抗性基因设计引物（EGFPF：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC，EGFPR：TTATTTGTAGAGCTCA TCCATGCC）并且委托广州天一辉远基因科技有限公司进行合成。PCR 体系为：2×PCR Mix（康为世纪）12.5 μL ， EGFPF （ 10 μmol/L ） 1 μL ， EGFPR（10 μmol/L）1 μL，无菌水9.5 μL，菌液1 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min，PCR 产物电泳检测。将阳性克隆命名为GMI1000-Tac-EGFP。

1.6 利用GMI1000-Tac-EGFP 分析R. solanacearum动态侵染过程

马铃薯‘陇薯7 号’组培苗培养20 d 后进行接种。接种后置于培养箱，28~30 ℃光照培养。在接种后每24 h 利用LUYOR-3415RG 双波长荧光蛋白激发光源在440 nm 激发下检测EGFP 表达，并且拍照记录。

结果与分析

2.1 pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功转入GMI1000

本研究通过电转化法成功地将 pBBR1MCS2-Tac-EGFP 转入到 GMI1000 中。通过 PCR 在GMI1000-Tac-EGFP中扩增出 750 bp左右的片段，与预期大小一致，而 GMI1000 中未扩增出相应片段（图 2）。同时在 LUYOR-3415RG 双波长荧光蛋白激发光源的蓝光下，GMI1000-Tac-EGFP 能够发出绿色荧光，而野生型 GMI1000 未发出荧光。研究结果证明 pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功转入到 GMI1000 中，并且能够在 GMI1000中表达 EGFP 蛋白。

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