基因研究如何选择理想的荧光蛋白？

荧光蛋白选择需要考虑的几个问题

荧光蛋白用于单色实验

对于单色实验，绿色荧光蛋白是最常用的。EGFP是更受欢迎的绿色荧光蛋白，是许多单色研究的理想选择。然而，其他绿色荧光蛋白，如TurboGFP（又名maxGFP），对于某些应用可能是一种更好的选择。TurboGFP比EGFP具有更优越的功能，如更明亮的绿色荧光，成熟速度更快，对高pH值和光稳定性耐受更强，这些使其成为早期信号检测和高灵敏度实验的理想选择。如果是红色荧光蛋白，mCherry则由于其单体结构，良好的荧光性质和低毒性等特点使其成为大多数实验的选择，它特别适用于蛋白标记或者当细胞中其他红色荧光蛋白发生细胞毒性或蛋白聚集时。在荧光蛋白发生二聚化和聚集的情况下，dTomato依然可以发出很亮的荧光。DsRed_Express2是另一个红色荧光蛋白的理想选择，它是具有最小细胞毒性的红色荧光蛋白。

荧光蛋白用于多色实验

对于同时使用多个荧光基团的实验（包括荧光蛋白和其他染料如DAPI），研究人员必须仔细考虑荧光基团的光谱性质，以确保激发光和发射光可以在显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备的滤光片上可以进行观察区分。通常情况下，荧光检测设备应该能够读出每种荧光的荧光信号，而相互不干扰。通过使用激发滤光片来激发目的荧光基团产生合适频率的激发光，使用发射滤片控制目的荧光基团的发射荧光进入荧光检测器。对于两种颜色，标准绿色荧光蛋白如EGFP加上标准红色荧光蛋白如mCherry几乎在所有荧光显微镜和流式细胞仪上都能正常工作。对于三种颜色，蓝色、绿色和红色荧光蛋白组合（如TagBFP + EGFP + mCherry）或青色、黄色和红色组合（例如CyPet + YPet + mCherry）可以很好的一起配合工作，因为这些组合在大多数荧光显微镜或流式细胞仪上易于分辨观察。

荧光共振能量转移（FRET）
荧光蛋白广泛应用于基于荧光共振能量转移（FRET）的实验中。FRET是一种物理过程，在此期间，受激发供体发色基团分子通过非放射性偶极间耦合将能量转移到受体发色基团。FRET会导致供体荧光强度衰减，而受体发射荧光增加。FRET需要一些前提条件：供体和受体必须很接近（10-100Å）；受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱重叠；供体和受体的跃迁偶极方向必须是平行的。FRET是距离依赖型的，且FRET的效率与供体和受体之间距离的六次方成反比。因此，它对于距离的微小变化非常敏感，使其成为许多研究应用的强大的工具，如研究DNA或蛋白质结构，研究分子间相互作用等。青—黄色供体/受体对CyPet-YPet常用于FRET实验。

荧光蛋白选择方案：

单荧光：EGFP，TurboGFP，mCherry，dTomato或DsRed_Express2（这些荧光蛋白可以跟DAPI一起使用）
双荧光：EGFP + mCherry或TurboGFP + mCherry （这些组合可以跟DAPI一起使用）
三荧光：TagBFP + EGFP + mCherry或CyPet + YPet + mCherry （如果使用合适的滤片，第二种组合可以跟DAPI一起使用）
FRET-based应用：CyPet - YPet

荧光蛋白表达为什么这么弱？

低到中等程度的抗性基因表达就能让细胞获得对药物的抗性。相反，荧光蛋白（FP）则需要高水平的表达才能获得明亮的荧光信号，较低或者中等程度的荧光表达会产生较弱的荧光信号，甚至会低于设备检测的更低临界值。此外，某些荧光蛋白（如EBFP）比常用荧光蛋白（如EGFP）更暗淡，特别难以检测。一些研究人员不得不使用抗荧光蛋白抗体，以可视化体外细胞培养或体内的荧光蛋白。以下是导致荧光不良的最常见原因：

弱启动子驱动荧光蛋白的表达
有一些启动子本身就比较弱（如UBC），只能驱动荧光蛋白的弱表达。有的启动子（如CMV）可以在体外细胞培养中很好地起作用，但有时在体内会沉默。当表达荧光蛋白时，您应该尽可能尝试使用一个强的广泛性启动子（如EF1A或CAG）。如果您必须使用组织特异性启动子，请尽可能选择一个表达能力强的；如果您必须使用弱或很弱的启动子，请为荧光蛋白信号不足的可能性做好准备。当这种情况发生时，这并不意味着您的荧光蛋白没有表达，它可能只是表达量不高。您可以使用更灵敏的检测方法，如RT-PCR或免疫荧光进行检测。

在慢病毒和MMLV载体中表达荧光蛋白
对于逆转录病毒载体系统（慢病毒或者MMLV），聚腺苷酸化信号（poly A）不能存在于LTR之间，因为这会抑制病毒的包装。多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中，来自上游启动子的转录会经过上游ORF的末尾继续往下游的启动子和ORF转录，这会导致下游ORF的表达部分受到抑制。当下游ORF为荧光蛋白时，其表达会大大减少。您可以采取如下措施提高荧光蛋白的表达：
•使用不同的载体系统，比如使用常规载体，腺病毒载体或腺相关病毒载体
•使用荧光更强的荧光蛋白变体（如TurboGFP代替EGFP）
•如果考虑在多顺反子的上游表达盒表达荧光蛋白，您可以使用2A linker连接目的基因和荧光蛋白基因。然而，这可能会影响多顺反子中其他ORF的生物学功能，也可能导致荧光蛋白表达较弱（见下文），且会增加载体构建的成本和时间。

在多顺反子中表达荧光蛋白
当在多顺反子中表达荧光蛋白基因时，通常会存在以下所述问题，且有时荧光蛋白基因的表达与上游下游ORF有关。
•荧光蛋白基因在IRES的下游
在包含一个或多个IRES元件的多顺反子中，与上游ORF相比，下游ORF表达水平比较低（通常为上游的10%-20%）。如果一个荧光蛋白在IRES的下游表达，则荧光会较弱。如果您必须在多顺反子的下游表达荧光蛋白，您可以考虑使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通过使用2A肽，多顺反子下游ORF通常与上游ORF的表达量相当（或稍微低一点）。然而，2A肽也有缺陷，如可能会影响靶基因（GOI）的功能。当存在多个2A肽时，下游ORF倾向于以较低水平表达。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。因此，不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物，在某些实验运用中，这是一个值得注意的问题。需要特别注意的是2A肽的切割会在上游蛋白的C末端留下额外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下额外的脯氨酸。在大多数实验应用中，这种情况不会产生不良影响，但是在某些情况下可能会影响蛋白功能。

•荧光蛋白是融合蛋白的一部分
融合蛋白几乎总是表现出比未融合蛋白较弱的荧光（比如EGFP/Neo融合蛋白的荧光比单独的EGFP荧光更弱）。此外，未经测试的融合蛋白可能存在胞内不稳定，错误折叠或无功能等问题。如果您怀疑这些是荧光弱的原因，可以尝试以下操作：

◦使用更强的启动子（例如EF1A）来驱动融合基因的表达
◦以非融合形式表达荧光蛋白
◦使用更亮的荧光蛋白变体（如TurboGFP代替EGFP）
◦增加一个linker，或者使用不同的linker来连接荧光蛋白和目的基因
◦调换荧光蛋白和目的基因的位置

荧光蛋白本身亮度低
一些荧光蛋白本身比同一颜色家族的其它种类荧光更暗。例如在蓝色家族中，EBFP的亮度仅为TagBFP亮度的三分之一。

荧光蛋白，荧光素酶哪个好？

荧光蛋白，萤光素酶都是基于重组蛋白的报告基因，可以用于定位或成像研究。然而，这几类蛋白各有不同，适用于不同的实验设计。荧光蛋白和萤光素酶都属于发光蛋白，可用照相机或类似的装置来检测荧光表达。荧光蛋白通过吸收一种颜色的光（激发），然后发出不同颜色（发射）的较低能量光来起作用。相反，萤光素酶（和其他生物发光酶）通过催化底物（即萤光素）发生化学反应而发光。
荧光蛋白比萤光素酶明亮得多，这有利于将其应用到许多不同类型的实验中。但是，在组织样品或活体动物中，背景、自发荧光和光散射等问题可能会影响荧光的观察。荧光素酶的活性分析需要萤光素，所以在分析之前必须将该底物加入培养基或注射到活体动物体内。与荧光蛋白相比，这可能会影响实验的重复性或定量。

荧光蛋白选择时需要考虑哪些参数？

激发波长/发射波长：每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长，因此，选择的荧光蛋白必须是使用的系统能够激发和检测到的。比如，使用的显微镜只有两个激发器，488 nm和561 nm，那就不能够选择远红外荧光蛋白。又比如，使用超过一个荧光蛋白时，必须确保他们的发射波长没有重叠。
寡聚反应：代荧光蛋白易于寡聚化，当和目的基因融合表达时，可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。因此建议使用单体的荧光蛋白，比如mCherry。
氧气：许多荧光蛋白的成熟需要氧气，特别是衍生自GFP的荧光蛋白，如果这些荧光蛋白处于缺氧环境，可能就观察不到荧光。
成熟时间：成熟时间是荧光蛋白正确折叠和产生发色团所需的时间。时间可能是几分钟到几小时，superfolder GFP (sfGFP)和mNeonGFP在37 °C所需时间小于10min；mCherry 大概需要15 min；TagRFP 大概需要100 min；DsRed 大概需要10 hours。
温度：温度会影响荧光蛋白的成熟时间和荧光强度，比如EGFP适合37 °C，所以EGFP最适合哺乳动物或者细菌的研究，而GFPS65T相对适合酵母的研究。
亮度：荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较，有一些荧光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考虑。
耐光性：长时间暴露在激发光下，荧光分子被漂白（即失去发光能力）。光稳定性可短至100毫秒（如EBFP）或长达1小时（如mAmetrine1.2）。但是，对于大多数荧光蛋白来说，它只需几秒钟到几分钟。另外，光稳定性可能也会受实验参数影响，例如激发光强度，pH或温度等。
pH稳定性：如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白，则此参数非常重要，一些荧光蛋白具有不同的ex/em光谱（例如mKeima）或在pH变化时荧光强度会发生改变（例如pHluorin，pHTomato）。

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